基因编辑与细胞治疗产业的快速扩张，对细胞内递送技术的精度、通量与生物安全性提出了前所未有的要求。转染作为将 DNA、RNA、蛋白等外源生物分子导入真核细胞的核心技术，是基因功能研究、CAR-T 细胞制备、CRISPR 基因组编辑的基础支撑环节。传统转染方法在处理原代免疫细胞、干细胞等难转染细胞时，普遍存在效率波动大、细胞活力损失严重、批次一致性不足等痛点，难以适配细胞治疗规模化生产的需求。近年来，依托微纳加工技术发展的微流控芯片平台，凭借微米级流体与细胞操控能力，在转染过程中实现了单细胞级别的精准外力调控，成为突破传统技术瓶颈的核心方向。本文将从技术原理、芯片制造工艺、应用场景与临床转化等维度，系统解读微流控转染系统的发展现状与产业价值。
1. 细胞内递送的技术价值与传统方案瓶颈
转染技术的核心价值在于通过人为干预细胞遗传信息，实现细胞功能的重编程。从基础研究层面，它支持基因过表达、沉默与编辑，是解析癌症、神经退行性疾病、感染性疾病分子机制的核心工具；从临床应用层面，它是基因治疗、CAR-T 免疫细胞治疗、重组蛋白疫苗生产的关键工序，直接决定最终产品的质量与成本。目前主流的转染方案可分为病毒载体与非病毒载体两大类，均存在难以忽视的技术短板。
图1. 细胞内生物分子递送的应用。细胞内递送技术各类应用的示意图，包括基因功能检测（基因沉默与过表达）、重组蛋白生产、疾病机制研究（神经退行性疾病与癌症研究）、基因治疗以及用于靶向癌症治疗的CAR-T细胞工程。
病毒载体转染以慢病毒、逆转录病毒为代表，是当前临床级细胞制备的主流方案，对 T 细胞的转染效率可达 94%，但存在固有缺陷：病毒基因组随机整合有诱发癌变的风险，载体本身具有免疫原性，且生产工艺复杂、成本高昂，载药量受病毒颗粒尺寸严格限制。非病毒方案中，化学转染依赖脂质体、阳离子聚合物等载体包裹核酸，操作简便但对原代细胞效率极低，且存在剂量依赖性细胞毒性；传统体相电穿孔依靠高压电场击穿细胞膜，虽能实现 70%-90% 的转染效率，但电场分布不均易导致细胞损伤不可逆，长期细胞活力差，且难以精准控制递送剂量。显微注射等高精度方法则通量极低，无法满足规模化需求。
正是传统方案的多重局限，推动了微流控技术与细胞转染的深度融合。微流控芯片可在微米级通道内实现流体、电场、力场的均匀分布，将转染的作用尺度从群体级压缩到单细胞级，在效率、活力、一致性三个核心指标上实现协同提升。
2. 微流控转染系统的核心技术路径
微流控转染系统依托精密设计的微通道结构，通过电、机械、声等不同物理机制瞬时通透细胞膜，实现生物分子的胞内递送。根据作用原理不同，可分为三大主流技术路线，各有适配场景与技术优势。
图2. 基于微流控的细胞内递送机制。四种主要的基于微流控的细胞内递送技术：挤压法——细胞在狭窄的收缩通道内发生变形，从而实现细胞膜的瞬时穿孔；电穿孔法——在微流控通道内对细胞施加电场，以形成细胞膜的瞬时微孔；声穿孔法——利用微通道内产生的超声波诱导细胞膜通透；以及剪切诱导流法——流体动力剪切力在细胞膜上形成瞬时开口，供分子进入。
1) 微流控电穿孔：精准可控的主流方案
微流控电穿孔是当前产业化程度最高的技术路线，通过微加工电极与微通道的配合，实现高度均匀的局部电场，在远低于传统电穿孔的电压下完成细胞膜通透。它分为静态与流通式两种架构：静态平台通过微孔、微涡旋等结构捕获单细胞，配合低电压脉冲实现温和转染，部分平台集成阻抗监测功能，可实时反馈细胞膜状态，优化转染参数，在胚胎转染实验中可实现 69.5% 的效率与 100% 的细胞存活率；流通式平台支持细胞连续流动处理，通过平行通道、液滴包裹等设计提升通量，高端平台对原代 T 细胞的 mRNA 转染效率可达 90%-99%，处理速度高达每分钟 1.6 亿个细胞，完全匹配临床级细胞治疗的产能需求。与传统电穿孔相比，微流控架构能有效抑制焦耳热与电解气泡，大幅降低细胞应激反应，干细胞转录组测序证实其引发的基因应激扰动远低于体相电穿孔。
图3。静态微流控电穿孔。（a）基于收缩的电穿孔中实时阻抗监测的结构和机制，包括该装置的横截面示意图。（b）用于胚胎电穿孔实验的实验装置，突出显示连接到注射泵、脉冲发生器和阻抗分析仪的电穿孔微芯片。（c）电穿孔率分析。（i）没有猫胚胎的孔口的明场图像。（ii）电穿孔前定位在孔口上的胚胎的荧光图像。（iii）孔口上胚胎3分钟post-electroporation的荧光图像。（a-c）经Springer Nature许可改编[34]（d）用于活细胞电穿孔递送和取样的LCAD结构和高通量分析工作流程。（e）组装的微流控设备的图像。（f）在PDMS孔中培养的表达MDA-MB231细胞的TdTo mato的荧光图像。\(Scale bar =100 \mu m\)。（g）多模式分析工作流程，包括LCAD培养孔的自动成像，然后使用MALDI-TOF进行深度学习细胞检测和特征提取（上）和高通量质谱（SAMDI）载玻片的酶活性测量（下）。（d-g）经美国化学学会许可改编[164]。
图4.微流控流通式电穿孔。（a）基于triDrop液滴的连续处理平台。与triDrop电穿孔平台相关的实验工作流程。示意图呈现了数字微流控设备的俯视图，显示了通过顺序电极驱动形成triDrop，红线表示在施加高压脉冲期间的电场分布。左插图呈现了triDrop芯片的横截面图。经Wiley-VCH GmbH许可改编[37]。（b）用于CRISPR编辑的大容量连续电穿孔芯片（LaViE-Chip）的示意图和图像。通过注射器泵将细胞和质粒的混合物注入芯片中。LaViE-Chip由2层组成：PDMS制成的通道层和玻璃制成的基板层。经Elsevier许可改编[39]。（c）用于经济高效且可扩展的iPSC生成的流通式微通道电穿孔器示意图。经公共科学图书馆（PLOS）许可改编[151]。（d）用于选择性细胞靶向的图像引导微流控电穿孔系统示意图，突出显示用于触发脉冲应用和光学反馈的组件。（e）显示选择性电穿孔的图像序列。这里，绿色荧光靶细胞接收由红色光学闪光指示的脉冲，而蓝色非靶细胞不受影响地通过电极。（d，e）经英国皇家化学学会许可改编[40]。（关于本图例中颜色参考的解释，读者请参阅本文的网络版本。）
2) 微流控机械穿孔：低损伤的创新路线
机械穿孔是微流控转染最具差异化的技术方向，依靠流体或结构产生的机械应力使细胞膜变形产生瞬时纳米孔道，全程无电场介入，最大程度保留细胞原始功能。它包含两种典型实现方式：一是机械压缩式，即细胞挤压技术，细胞通过小于自身直径的微缩窄通道时发生快速形变，细胞膜产生瞬时孔隙，该技术已进入 HPV 肿瘤疫苗的 1/2 期临床试验，24 小时内即可完成细胞产品制备，且能诱导有效的抗肿瘤免疫应答；二是流体剪切诱导式，通过粘弹性流体、涡旋脱落、十字交汇流等流体效应产生剪切力，实现无接触式细胞膜通透，部分平台通量可达每分钟 3 亿个细胞，制备的 CAR-T 细胞增殖能力与杀伤功能显著优于传统电穿孔方案，整体细胞产量提升 1.7-2 倍。液滴式机械穿孔则将单细胞包裹在皮升级液滴中通过缩窄结构，进一步提升了处理均匀性，降低通道堵塞风险，CRISPR 基因编辑效率是传统电穿孔的 3-6 倍。
图5. 基于微流控挤压的机械穿孔技术。(a) 集成柔性气动微阀的三层微流控装置示意图，该装置可实现可调谐且适配的细胞挤压。(b) 经3千道尔顿得克萨斯红葡聚糖和钙黄绿素AM标记的MCF-7细胞的荧光及明场图像。(c) 不同微通道键合速度下制备的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜图像。(a-c) 经许可改编自2025年美国化学学会版权[43]。(d) 脂质纳米颗粒（LNP）-机械穿孔平台示意图，以及负载质粒DNA（pDNA）的脂质纳米颗粒用于嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）工程的胞内递送示意图。(e) 微流控挤压装置示意图，明场图像显示细胞通过单个收缩通道时的变形情况。(f) 转染后CD45+ Jurkat细胞（红色）中绿色荧光蛋白（GFP）表达（绿色）的荧光图像。(d-f) 经许可改编自威利-VCH股份公司[44]。(g) 用于高效成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）递送的液滴细胞夹持微流控系统示意图。(h) 液滴细胞机械穿孔介导胞内递送机制的示意图。(i) 明场及荧光图像，显示通过液滴细胞夹持将3-5千道尔顿异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖递送至K562细胞中（比例尺：200微米）。(j) 高速显微镜图像，展示稳定液滴生成、细胞包封、鞘流诱导加速及液滴细胞夹持过程。(g-j) 经许可改编自施普林格自然集团[45]。（欲解读本图例中颜色的参考信息，读者可查阅本文的网络版本。）
图6. 基于微流控剪切的机械穿孔技术。(a) 细胞通过收缩阵列时，粘弹性流体诱导细胞变形并实现胞内递送的示意图。(b) 微通道收缩处由粘弹性流体介导的细胞变形诱导膜破裂的示意图，以及微流控装置的实物图。(c) 整个收缩阵列的放大视图（左图）和收缩阵列的扫描电子显微镜图像（右图）。(d) MDA-MB-231乳腺癌细胞在芯片外（对照组）或经2%聚环氧乙烷（PEO）溶液中通过微流控收缩阵列递送后，负载异硫氰酸荧光素-葡聚糖的明场和荧光图像。(a-d) 经Elsevier出版社许可改编[48]。(e) 粘弹性挤压微流控装置的示意图。(f) 高速明场图像显示K562细胞通过虚拟通道（流速 r \(ratio =0.5\)）。(g) 粘弹性挤压的工作原理：流射流区域（红色）使细胞变形，形成瞬时膜孔。通过改变样品液与鞘液的流速比可调节虚拟通道宽度（W），而挤压长度（L）和宽度则决定细胞变形程度。(h) 明场和荧光图像显示，经微流控处理后，异硫氰酸荧光素-葡聚糖（2000 kDa）成功递送至Jurkat细胞中，未处理的对照组未观察到荧光。比例尺：40微米。(e-h) 经Wiley-VCH有限公司许可改编[49]。(i) 滴注式微流控涡旋脱落系统（DμVS）的概述，展示系统组成部件。电子压力调节器驱动细胞悬液通过μVS芯片实现透化，随后通过Telios软件在自动化控制下分配至微孔板孔中。(j) 示意图展示细胞处理流程：在μVS处理前与荧光葡聚糖（3 kDa）预混合，或在μVS处理后与标记葡聚糖后混合。(i,j) 经Wiley出版社许可改编[50]。(k) Y型接头的示意图和成像概览 (l) 高速显微镜图像显示自然杀伤细胞的流体动力学拉伸。(m) 细胞在芯片外（对照组）或经水力穿孔递送后，负载异硫氰酸荧光素-葡聚糖的明场和荧光图像。(n) 荧光强度直方图显示2000 kDa异硫氰酸荧光素-葡聚糖递送至自然杀伤细胞的情况（每个样品5000个细胞）。所有比例尺：10微米。(k-n) 经Wiley-VCH有限公司许可改编[52]。（欲解读本图例中颜色的参考含义，读者可查阅本文的网络版本。）
3) 微流控声穿孔：温和适配敏感细胞
声穿孔利用超声驱动微泡空化产生的剪切力通透细胞膜，微流控平台可精准控制微泡分布与声场强度，解决了传统体相声穿孔均匀性差的问题。部分无造影剂的声流控平台采用压电换能器与玻璃毛细管架构，可直接处理造血干细胞、原代免疫细胞等敏感细胞类型，对 Jurkat 细胞的转染效率达 62%，细胞活力保持在 80% 以上，为免疫细胞制造提供了低损伤的备选方案。3D 打印的微泡阵列芯片则可实现细胞团的同步声穿孔，处理通量与均匀性进一步提升。
图7. 微流控声孔效应。(a) 声流体装置的示意图与高速图像，展示目标细胞在压电换能器上方的玻璃毛细管中流动以接受处理，同时呈现模拟的声压分布以及Jurkat细胞运动的时序图像（比例尺：50微米）。(b) 共聚焦图像显示经声处理和未经处理的Jurkat细胞中Cy3标记的DNA定位情况，荧光曲线表明DNA实现了细胞膜、细胞质和细胞核的递送（比例尺：10微米）。(a,b) 经《美国国家科学院院刊》[216]许可改编。(c) 基于微泡的微流控声孔效应装置示意图。1、2、3为三个温度测量位置。经Frontiers Media SA[54]许可转载。(d) 声流体装置的示意图，展示超声换能器与3D打印流动腔耦合，蠕动泵驱动流体流经通道以增强细胞内递送效率。(e) 共聚焦图像呈现声流体处理对细胞结构的影响，对照组细胞仅出现轻微损伤，处理组细胞则出现结构改变，且内质网（红色）、高尔基体（绿色）和溶酶体（深蓝色）发生核通透现象（比例尺：10微米）。(d,e) 经Elsevier[55]许可改编。（欲解读本图图例中的颜色参考，读者可查阅本文的网络版本。）
3. 微流控转染芯片的制造工艺与材料体系
微流控转染芯片的性能高度依赖制造精度与材料稳定性，其制备覆盖了完整的微纳加工产业链，核心工艺与材料方案如下：
1) 模具制备与芯片成型工艺
微通道结构的母模是芯片制造的核心基础。实验室研发阶段普遍采用 SU8 光刻胶模具，通过紫外光刻工艺定义高精度微结构，成本低、迭代快；面向小批量量产时，纯硅模具、金属生物芯片模具具备更高的耐用性，通过深硅刻蚀、激光微加工等工艺制备，可支持上千次 PDMS 浇筑。PDMS 芯片凭借优异的生物相容性、光学透明性与弹性，是转染类芯片的主流材料，通过 PDMS 浇筑、真空脱泡、加热固化后脱模得到通道层，再配合 PDMS 等离子键合机完成与玻璃基底的不可逆封接，PDMS 键合对准平台则保障多层芯片的精准组装。
除 PDMS 外，玻璃芯片、COC 芯片、PMMA 芯片也广泛应用于不同场景：玻璃芯片耐有机溶剂、背景荧光低，适配高分辨率成像与长时间细胞培养；COC 芯片热稳定性与机械强度优异，支持注塑法规模化量产，是工业化芯片的首选材料。
2) 表面修饰与生物界面优化
为适配不同细胞与流体特性，需对芯片内壁进行针对性表面修饰。氨基化修饰、醛基化修饰可改变表面电荷，促进细胞贴壁或核酸富集；PEG 修饰可实现长效亲水处理，抑制蛋白非特异性吸附，保障流体稳定与细胞悬浮状态；环氧基修饰、羧基修饰等功能化处理则可固定生物探针，实现芯片的检测功能集成。针对长期细胞培养场景，长效疏水处理或细胞外基质包被可进一步提升生物相容性。
3) 集成化 MEMS 加工工艺
高端功能型转染芯片需集成微电极、传感器等单元，依托 MEMS 加工工艺实现一体化制备。通过电子束光刻、薄膜沉积、刻蚀代工等工艺，可在芯片上制备高精度微电极阵列与阻抗检测单元，实现转染过程的实时监测与闭环控制；阳极键合工艺用于硅 – 玻璃复合芯片的封装，保障芯片的高压密封性与机械强度，适配高参数电穿孔场景。
4. 临床转化挑战与产业发展趋势
微流控转染技术已在细胞治疗、基础研究等领域展现出显著优势，但全面商业化仍面临三大挑战：一是工艺标准化程度不足，不同细胞类型与递送物需针对性优化参数，增加了 GMP 合规的复杂度；二是规模化放大的稳定性，从实验室单通道芯片到工业化多通道并行系统，需解决流体均匀性、热管理、芯片耐用性等工程问题；三是设备易用性与成本，当前专业微流控系统操作门槛较高，需进一步简化流程、降低耗材成本，才能向普通生物实验室与临床机构普及。
长期来看，微流控转染技术有三大明确发展方向：其一，多模态混合转染，结合机械、电、声等多种刺激机制，协同提升递送效率与细胞活力，适配更广泛的细胞与分子类型；其二，智能化全流程闭环，集成实时成像与 AI 算法，动态调控流速、电压、压力等参数，减少人工经验依赖，提升批次一致性；其三，与器官芯片、3D 细胞培养芯片深度融合，构建从基因编辑到功能验证的一体化微流控平台，大幅缩短新药研发与疾病模型构建周期。
随着微纳加工工艺的成熟与国产替代进程加速，PDMS 芯片、玻璃芯片的制造成本持续下探，标准化微流控转染设备有望成为细胞治疗生产线的核心配置，推动基因与细胞治疗产业向高精度、低成本、规模化方向升级。
参考文献：https://doi.org/10.1016/j.addr.2026.115818
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