红细胞承担着氧气与二氧化碳输运的核心生理功能。在约120天的生命周期内，红细胞需反复穿过直径仅3至5微米的毛细血管，远小于其自身7至8微米的直径。因此，卓越的变形能力及抗疲劳特性是维持红细胞正常流动的必要条件。红细胞独特的双凹圆盘状结构与由脂质双分子层和膜骨架网络构成的复合细胞膜，赋予其良好的粘弹性，确保反复大变形后仍能迅速恢复。
然而，红细胞的抗疲劳能力并非无限。在体外储存或病理状态下，细胞膜损伤将不可逆累积，例如2型糖尿病患者的红细胞剪切模量较健康状态提升约2倍。在此背景下，微流控芯片技术结合介电泳技术，为单细胞力学表征提供了非接触式、高通量的全新研究范式。
二、介电泳微流控实验平台的构建与PDMS芯片制备
2.1 芯片材料选择与结构设计
微流控芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流道层与玻璃基底电极层构成。PDMS具有优异的光学透明性、生物相容性及低成本快速成型优势，是PDMS微流控芯片制备的首选材料。PDMS流道尺寸为长10毫米、宽500微米、高50微米，玻璃基底表面镀有100纳米厚的交叉金电极，宽度与间隙均为20微米，用于构建非均匀电场。
2.2 软光刻工艺与等离子体键合
芯片采用标准软光刻工艺制备：先通过光刻技术在硅片上制作SU8光刻胶模具，再将PDMS预聚物浇筑于模具上，加热固化后剥离得到微流道结构层。该PDMS芯片制备方法可实现微米级精度的微流道加工，且模具可反复使用。PDMS层与玻璃基底的封装采用等离子体键合技术，通过PDMS等离子键合机使PDMS表面产生活性基团，与玻璃基底羟基发生共价键合，形成不可逆密封结构。
2.3 系统集成与设备配置
实验平台由注射泵、波形信号发生器、微流控芯片、显微镜和高速相机组成。信号发生器输出高频正弦交流信号（有效电压2V，频率1.825MHz）驱动金电极。该微流控系统耦合介电泳技术与微流控芯片，可对单细胞或多细胞群体实现长时间、可控的循环力学加载。
图 1 介电泳微流控实验平台示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the dielectrophoretic microfluidic experimental platform
3.1 样品制备与介电泳机制
血液样本采集自健康志愿者。由于临床储存液电导率较高会产生剧烈焦耳热，研究选用低电导率工作缓冲液（电导率0.02 S/m），同时维持等渗环境。实验前需进行芯片表面修饰以防止红细胞非特异性粘附。介电泳是指电中性微粒在非均匀电场中因极化差异产生平移运动的现象，红细胞受介电泳力作用被电极边缘捕获并拉伸，这一非接触式加载方式避免了机械损伤，更能模拟微血管中的挤压变形过程。
3.2 Kelvin-Voigt粘弹性模型
研究采用Kelvin-Voigt模型定量表征红细胞膜粘弹性，可解耦剪切模量（μ）和膜粘度（η）两个关键参数。剪切模量反映抵抗剪切形变的刚性程度，剪切粘度表征形变过程中的内摩擦阻力。实验采用指数衰减函数对伸长比λ(t)分段拟合，电场调制周期为4秒（开启2秒，关闭2秒），每组保证不少于15个红细胞样本。
4.1 最大伸长比的衰减规律
对不同储存时长（0、4、7、13天）的红细胞施加循环电变形载荷，结果显示各组最大伸长比λmax均随循环次数N增加而递减。储存第四天的红细胞首次加载λmax为1.75，经900次循环后降至1.64，最终衰减至1.24，较初始下降约29.1%，表明长时程循环拉伸导致不可逆转的膜疲劳损伤。
图 2 红细胞拉伸-松弛过程 Fig. 2 Stretch-relaxation process of red blood cells
4.2 剪切模量与粘度的两阶段演化
剪切模量和剪切粘度均呈单调递增，疲劳演化分为两阶段：累积阶段（N < 2250），力学性能线性衰退，储存13天组剪切模量提升270%、粘度提升382%；临界恶化阶段（N > 2250），剪切模量非线性跃升，储存13天组高达503%，表明疲劳损伤突破临界阈值，膜结构刚性急剧增加。
图 3 在不同的拉伸次数下储存第四天的红细胞伸长比λ(t)随拉伸时 间t 的变化关系 Fig. 3 Relationship between elongation ratio \(\lambda(t)\) and time t for the RBC stored for four days under different numbers of stretching cycles N Fig.3
4.3 储存天数对疲劳敏感性的调控
短中期储存（0至7天）内，粘弹性参数呈渐进式增长；但储存至13天时，力学性能显著恶化，剪切模量和粘度分别增至新鲜对照组的1.6至6倍和1.3至6.5倍。储存13天组在2250次循环后剪切模量跃升至初始值的5至6倍，提升幅度超250%，表明长期储存显著放大疲劳损伤效应。
图 4 不同储存天数下红细胞( \((n=15)\) )最大伸长比与拉伸次数 N 的关系 Fig. 4 Relationship between the maximum deformation of RBCs \((n=15)\) and the number of stretching cycles N under different storage days
图 5 红细胞在不同储存天数下剪切模量 μ 及剪切粘度 \(“)\) 与拉伸次数即循环周期数 N 的关系 Fig. 5 The relationship between the shear modulus and shear viscosity of RBCs and the number of stretching cycles N under different storage days
红细胞疲劳规律与临床输血安全性密切相关。储存时间延长导致ATP耗竭及氧化应激，红细胞膜刚度增加、变形能力衰退，输注后循环存活率低、微血管通过性差。本研究建立的力学量化方法可为优化红细胞储存方案、制定输血时限提供力学依据。
从产业角度看，介电泳微流控平台代表了微流控芯片定制与加工服务的高端方向。随着类器官芯片和器官芯片领域发展，市场对PDMS芯片、玻璃微流控芯片及COC微流控芯片的需求持续增长。微流控芯片加工企业需具备从芯片设计、模具制备到键合封装的全链条能力，PDMS芯片加工平台、微纳加工平台及MEMS加工技术是核心竞争力。PDMS适用于研发快速原型，玻璃微流控芯片适合高光学性能场景，COC芯片和PMMA芯片在量产中具有成本优势。
该平台具有良好可拓展性，未来可开展病理与健康红细胞对比研究，建立基于力学表型的疾病评估模型。机制层面可聚焦疲劳损伤与能量代谢及氧化应激的联系，结合蛋白质组学技术在分子层面揭示力化耦合机制。随着电子束光刻、深硅刻蚀等微纳制造工艺进步，微流道加工精度将进一步提升，器官芯片与类器官芯片的融合将推动微流控平台向多器官、多尺度仿生系统发展。
综上，本研究基于介电泳微流控平台，揭示了循环拉伸诱导的累积性膜疲劳硬化是红细胞变形能力衰退的主因，储存时长通过降低膜结构稳定性加速这一过程，为理解红细胞力学适应机制及微流控技术在生物医学中的应用提供了新视角。
| 参考文献：doi:10.11729/syltlx20250118 |
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