在临床抗感染治疗领域，抗生素敏感性检测始终是指导用药方案的核心依据。传统的药敏试验方法如纸片扩散法、E-test试验和微量肉汤稀释法，均基于大体积菌群的批量培养模式，通过测定最低抑菌浓度（MIC）来评估抗生素效果。然而，真实感染场景中，细菌往往以小规模局部群体的形式存在——皮肤毛孔、骨骼腔隙、巨噬细胞内部等微环境中，菌群数量可能仅为几个到几十个细胞。这种群体规模的差异，可能导致传统批量检测结果与实际临床疗效之间出现显著偏差。
图1. 研究大肠杆菌小种群对抗生素随机响应的实验流程。首先，在微量滴定板中进行微量肉汤抗生素敏感性测试，以确定每种抗生素的最低抑菌浓度。利用该步骤的信息，为组合液滴测定确定每种抗生素的六种批量测定的亚抑菌浓度（即对细菌生长无抑制或仅有轻微抑制）。随后，利用多重检测平台制备不同抗生素和浓度的液滴文库（平台照片见支持信息图S2）[43]。随后将液滴文库在37℃下动态孵育，通过为所有液滴提供均匀的氧气环境来实现统一的细菌生长条件[38]。在明场和荧光显微镜通道中于3个时间点（0、8和24小时）对液滴进行成像，分析数据以探究小细菌种群在不同浓度下对不同抗生素的随机响应。
微流控芯片技术的兴起为解决这一科学难题提供了全新路径。作为微纳加工技术在生命科学领域的重要应用，微流控芯片能够在微米级尺度的流体通道中实现对液体的精确操控。液滴微流控作为其中的重要分支，利用两相不混溶液体的流动特性，可高通量生成纳升至皮升级的均匀液滴，每个液滴相当于一个独立的微型反应器。这种技术天然适合研究小群体微生物的生理行为，因为它不仅能实现数万个样本的平行分析，还能通过泊松分布精确控制每个液滴中的初始细菌数量，模拟真实感染中菌群的空间分布特征。
近年来，MEMS加工工艺的成熟推动了微流控芯片的产业化发展。从光刻、电子束光刻到深硅刻蚀，从薄膜沉积到表面修饰，完整的微纳制造工艺链使得高精度微流道加工成为可能。特别是PDMS芯片因其良好的生物相容性、光学透明性和气体渗透性，成为微生物学研究的主流芯片材料。PDMS芯片的制备通常需要经过SU8光刻胶模具制作、PDMS浇筑固化、等离子体键合等关键步骤，专业的PDMS加工设备和PDMS工作站能够大幅提升芯片制备的重复性和可靠性。
二、PDMS芯片制备与组合液滴生成系统构建
开展小群体细菌抗生素响应研究的首要前提，是构建稳定可靠的组合液滴生成平台。研究团队采用的多路复用液滴微流控系统，核心在于能够在单次实验中同时测试多种抗生素和多种浓度条件，显著提升实验通量和数据可比性。这一技术突破依赖于精密的微流控芯片设计和先进的液滴编码方案。
PDMS芯片的制备是整个实验体系的基础。首先通过光刻工艺在硅片上制作SU8模具，形成微流道的阳模结构；随后将PDMS预聚体与固化剂按比例混合后浇筑在模具上，经PDMS烘箱或PDMS热板加热固化后剥离，得到带有微流道结构的PDMS基片。打孔完成后，利用PDMS等离子键合机将PDMS基片与玻璃载片进行不可逆封合，形成完整的微流控芯片。PDMS键合对准平台的使用确保了通道对齐的精度，对于多层结构芯片尤为重要。
芯片表面修饰也是影响液滴生成质量的关键因素。为了形成稳定的水包油或油包水液滴，需要对微流道内壁进行疏水修饰或亲水修饰处理。常用的表面改性方法包括PEG修饰、氨基修饰、醛基化修饰等，通过在通道内壁接枝功能化分子来调节表面能。长效亲水处理或长效疏水处理能够保证芯片在长时间实验中维持稳定的液滴生成状态，避免液滴融合或通道吸附等问题。对于生物芯片应用，醛基玻片、羧基玻片等功能化载玻片也常被用作键合基底，以满足不同的生物固定需求。
图2. 液滴文库的成像、实验条件解码及图像分析。图A展示了在红色、远红色和蓝色荧光通道下成像的液滴文库。这些通道中的荧光信号编码了对应每个液滴的实验条件。图B为一次实验中8小时成像的液滴解码色码t-SNE图。该液滴混合物共包含19种实验条件，这些条件通过机器学习算法进行识别[43]，图例显示了每种色码对应的抗生素及浓度（四环素：tet、链霉素：st、氨苄西林：amp）。图C和图D展示了孵育8小时和24小时后在明场（BF）和黄色荧光蛋白（YFP）通道下成像的液滴。这些图像用于分析细菌的生长、形态及杀伤情况，具体通过图E所示的图像处理操作实现（明场图像步骤：对比度增强、Canny边缘检测、液滴掩膜、闭运算和膨胀运算；YFP图像仅应用强度阈值处理；完整细节见实验部分）。
组合液滴生成的核心创新在于荧光编码技术。实验中使用红色、远红色和蓝色三种荧光染料的不同浓度组合，为每种实验条件分配唯一的颜色条码。通过机器学习算法对采集的荧光图像进行解码，可以在混合液滴库中准确识别每个液滴对应的抗生素种类和浓度。这种方案使得单次实验可同时测试多达91种不同条件，极大提升了筛选效率。本研究中同时测试了19种条件，包括3种抗生素各6个亚抑菌浓度梯度以及空白对照组。
研究以大肠杆菌K12菌株为模式生物，在每个液滴中平均封装约8个细菌细胞，模拟感染初期的小群体状态。实验选用了三种作用机制迥异的临床常用抗生素——四环素、链霉素和氨苄西林，分别代表抑菌型核糖体靶向药物、杀菌型核糖体靶向药物和杀菌型细胞壁靶向药物。通过明场和荧光显微镜在0小时、8小时和24小时三个时间点对液滴进行成像，结合图像分析算法定量评估细菌生长状态和形态变化。
研究最核心的发现是：小群体细菌对抗生素的响应模式与批量培养结果存在显著差异，且这种差异具有抗生素依赖性。批量药敏试验中被判定为亚抑菌浓度的抗生素剂量，在小群体环境中可能产生完全不同的生物学效应。这一发现挑战了传统药敏检测的基本假设，提示最低抑菌浓度的测定结果可能无法直接外推到空间异质性的真实感染场景。
造成这种差异的原因主要来自两个方面：其一，基因表达的随机波动导致同基因细菌个体之间存在表型异质性，这种异质性在小群体中被放大，产生群体水平的随机效应；其二，泊松分布导致各液滴的初始细菌数量存在差异，进一步增加了群体响应的离散度。两种随机性的叠加，使得小群体可能呈现出批量实验中观察不到的涌现性行为。液滴微流控的高通量特性，使得研究者能够捕捉并统计分析这些随机事件，而这正是传统培养方法无法实现的。
四环素作为典型的抑菌型抗生素，通过结合核糖体30S亚基抑制蛋白质合成。批量实验中该菌株的最低抑菌浓度为4 μg/mL，因此液滴实验选用0-0.5 μg/mL的亚抑菌浓度范围。
图3. 本研究液滴群体的四环素敏感性（结果展示的是生物学重复1的情况）。图(A)为微量滴定板批量培养敏感性测定的结果。基于该测定，本研究大肠杆菌菌株的四环素最低抑菌浓度为\(4 \mu g mL^{-1}\)。图(B)展示了在\(0.275 \mu g mL^{-1}\)下三个时间点随机选取的液滴图像，以整体呈现数据情况。图(C)和(D)为孵育8小时和24小时后，暴露于不同四环素浓度的单个液滴生长情况的小提琴图。红色虚线为计算得出的阈值，用于识别细菌生物量升高的液滴（生物学重复1的阈值为3.4）。图(E)和(F)为孵育8小时和24小时后的黄色荧光蛋白（YFP）细胞计数；红色虚线代表代谢活性的阈值（计数大于零）；参见图(G)，该图展示了具有代谢活性的液滴比例。图(H)展示了通过明场图像分析得出的生长量高于阈值的液滴比例（图(C)和(D)中的红色虚线）。误差棒的计算方法为：将每种抗生素浓度的数据集随机划分为三个子集，然后计算这三个子集平均值的标准差。液滴的最小数量为\(n=127\)，最大数量为\(n=439\)（详见支持信息表S1）。
令人意外的是，小群体对四环素的生长响应呈现明显的非单调特征。在0.275 μg/mL的中间浓度下，细菌生长速率反而与无药对照组相当，抑制效应出现了”放松”现象。这一现象在两次生物学重复中均稳定出现，被认为是一种低剂量毒物兴奋效应（hormesis）——低浓度的有毒物质反而刺激生长。研究者推测，这可能是由于低浓度四环素诱导了细菌外排泵的表达上调，增强了药物排出能力；但在更高浓度下，外排系统不足以抵消药物的毒性作用。有趣的是，小群体中这一效应出现的浓度远高于批量培养中的报道，提示微环境和群体规模可能改变兴奋效应的剂量窗口。
从形态学角度，四环素处理下的细菌保持正常杆状形态，未出现明显丝化，符合其蛋白质合成抑制的作用机制。同时观察到抗生素处理组的细菌聚集程度低于对照组，可能与药物诱导的运动性增强有关。24小时后，各浓度组的生长水平趋于一致，印证了四环素的抑菌而非杀菌特性。
链霉素属于氨基糖苷类杀菌抗生素，同样靶向核糖体但作用机制不同，最终导致细胞死亡。批量实验中最低抑菌浓度为4 μg/mL，液滴实验选用0.1-0.7 μg/mL的浓度范围。
链霉素作用下的小群体呈现出显著的双峰响应模式：一部分液滴中的菌群持续生长，另一部分则被完全抑制。即使在最高测试浓度下，仍有约50%-60%的液滴保持代谢活性。这种全或无的响应模式无法从批量实验中推测，因为批量测量只能得到平均效应，掩盖了群体间的离散性。
图4.我们的液滴群体的链霉素敏感性（结果显示为生物复制1）。面板（A）显示了一系列抗生素浓度的批量培养微量滴定板测定的结果。最小抑制浓度为\(4 \mu g mL^{-1}\)。（B）显示了三个不同孵育时间点在\(0.35 \mu g mL^{-1}\)的YFP通道中随机选择的液滴的图像。孵育8和24小时后单个液滴群体的生长的小提琴图，基于明场图像分析，显示在（C）和（D）中。虚线红线表示用于区分空液滴和填充液滴的阈值，如正文中所述（阈值为3.4）。从YFP图像获得的代谢活性细菌计数的小提琴图显示在（E）和（F）中，用于孵育8和24小时。红色虚线显示了定义代谢活性（1个或多个活性细菌）的阈值。显示代谢活性的液滴分数（来自YFP分析）在（G）中显示为链霉素浓度的函数。显示生长高于明场阈值的液滴分数在（H）中显示。通过将每个抗生素浓度的数据集随机拆分为三个子集并报告三个子集的平均值均方差来计算误差条。最小液滴数\(n=229\)和最大\(n=437\)（见表S2，支持信息）。
这一双稳态现象具有重要的理论意义。理论模型曾预测，当抗生素与核糖体的结合不可逆时，细胞命运取决于药物-核糖体结合速率与新核糖体合成速率之间的竞争，可能产生双稳态开关效应。本研究的液滴实验数据为这一理论预测提供了实验佐证。此外，链霉素同样降低了细菌聚集程度，促进细胞分散，这与亚抑菌浓度氨基糖苷类药物增强细菌运动性的已有报道一致。
氨苄西林属于β-内酰胺类抗生素，通过抑制青霉素结合蛋白干扰细胞壁肽聚糖合成，最终导致细菌裂解死亡。批量实验中该菌株的最低抑菌浓度高达150 μg/mL，而液滴实验仅使用5-25 μg/mL的浓度范围。
氨苄西林处理后最直观的形态变化是细菌丝化——由于细胞分裂被抑制而细胞伸长继续，形成长丝状细胞。定量分析显示，8小时时约45%的细胞呈现丝化形态，但24小时后丝化比例大幅下降，伴随大量细胞裂解和代谢活性丧失。这表明丝化只是药物作用的中间阶段，最终仍走向细胞死亡。
图5. 本研究液滴群体的氨苄西林敏感性（结果为生物学重复1）。图(A)展示了不同氨苄西林浓度下的批量培养微孔板实验结果。基于这些结果，该抗生素的最低抑菌浓度为\(150 \mu g mL^{-1}\)。图(B)展示了在三种高浓度氨苄西林作用下，液滴中代谢活性细胞在24小时后的黄色荧光蛋白（YFP）通道和明场通道成像结果（重复1；数字表示抗生素浓度，单位为\(\mu g mL^{-1}\)）。单个小型细胞（红色圆圈标注）可能为持留菌。图(C)展示了液滴内呈丝状的细胞占比，该占比为所有液滴的平均值。误差棒代表液滴间的标准差，下限为零。图(D)展示了基于黄色荧光蛋白（YFP）图像数据定义的代谢活性液滴占比（即含有至少一个黄色荧光蛋白信号的液滴）。误差棒代表标准差。图(E)和(F)为培养8小时和24小时后液滴中黄色荧光蛋白（YFP）细胞数的小提琴图。图(G)和(H)为基于明场图像分析得到的培养8小时和24小时后细胞生长情况的小提琴图。红色虚线代表鉴定生长液滴的阈值（生物学重复1的明场图像阈值为3.4）。液滴的最小数量为\(n=177\)，最大数量为\(n=422\)（详见支持信息表S3）。
最引人注目的发现是，小群体对氨苄西林的敏感性远高于批量培养。即使在最低的5 μg/mL浓度下，24小时后已有超过80%的液滴丧失代谢活性，而批量培养中50 μg/mL仍有明显生长。研究者提出了几种可能的解释：一是群体协作效应，批量中耐药亚群的存在可能保护整个群体；二是细胞间信号传导诱导的耐药机制在大群体中更有效；三是预存的异质性耐药细胞在批量环境中能够扩增并主导群体，而在液滴中被隔离无法发挥群体保护作用。此外，在高浓度氨苄西林处理的液滴中观察到极少数体积很小的存活细胞，推测可能是持留菌（persister）——一类生长缓慢、耐受抗生素的生理变异体。
这项研究不仅在基础微生物学层面揭示了小群体抗生素响应的独特规律，更对临床抗感染治疗具有重要的启示意义。传统药敏检测基于大群体批量培养，其得出的最低抑菌浓度可能低估了抗生素对局部小感染灶的实际效果，尤其是对于β-内酰胺类药物。反过来，低浓度抗生素的兴奋效应和双峰存活现象也提示，药物浓度不足的感染部位可能成为耐药进化的温床。
液滴微流控技术为下一代药敏检测提供了技术原型。结合器官芯片和3D细胞培养芯片技术，未来可以构建更接近真实感染微环境的体外模型，包括类器官芯片共培养系统，在组织水平评估抗生素穿透和抑菌效果。微流控类器官培养芯片的发展，将使得药物筛选从细胞水平跃升到组织水平，大幅提高临床转化效率。
从技术发展角度，微纳加工工艺的持续进步将进一步推动这一领域的发展。MEMS代工服务的成熟使得定制化微流控芯片的制备成本不断降低，微纳加工平台和微纳加工实验室的普及也为更多生物学研究者提供了技术准入机会。电子束光刻加工、深硅刻蚀、阳极键合等先进工艺的应用，将支持更复杂的三维微流控结构和集成微阀微泵的开发。同时，芯片表面修饰技术的多样化——从PEG修饰、氨基修饰到醛基化修饰——为生物分子固定和细胞 patterning 提供了更多选择。
展望未来，组合液滴微流控技术的应用场景将不断拓展。除了单一菌种的抗生素敏感性测试，该平台还可用于研究多物种微生物群落的空间动态、抗生素联合用药效果筛选、以及耐药进化轨迹追踪。随着微流控芯片设计和检测技术的不断进步，以及PDMS芯片制备方法的标准化，这一技术有望从实验室研究走向临床应用，为精准抗感染治疗提供全新的工具和思路。
| 参考文献：DOI: 10.1002/smsc.202500421 |
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