过去十年间，超分辨显微成像（SRM）技术取得了突破性进展，为生物系统纳米尺度结构研究提供了前所未有的洞察力。单分子定位显微镜（SMLM）作为超分辨技术的重要分支，能够实现纳米级别的定位精度，广泛应用于蛋白质共定位分析、细胞器组织研究以及复杂生物环境中的分子相互作用探索。然而，要实现高精度的纳米尺度成像，不仅需要光物理层面的优化，更需要对实验腔室内的环境进行精确控制。
在众多SMLM技术路线中，DNA-PAINT（DNA点累积用于纳米形貌成像）技术凭借其独特优势脱颖而出。该技术基于短荧光标记的”成像链”与靶标分子上互补”对接链”的瞬时结合原理，有效规避了光漂白限制，实现了近乎无限的成像时间和高标记密度。更为重要的是，DNA-PAINT具备强大的多重成像能力：通过为不同靶标分配独特的DNA序列，可借助Exchange-PAINT实现序贯成像，或通过光谱分离、荧光寿命DNA-PAINT（FL-PAINT）实现并行多重检测。
尽管多重成像技术不断演进，SUMPAINT、FLASH-PAINT等二次标记方法将神经元成像靶标数量提升至30个，Nanoplex可擦除标记技术将STED显微镜多重成像推至21色，RESI序贯成像技术更是树立了分子分辨率制图的新标杆，但这些技术均依赖反复的人工缓冲液交换操作。传统手动操作流程不仅繁琐耗时，还易引入样本漂移和实验变异性，严重影响实验结果的可重复性。微流控技术的引入为解决这些痛点提供了理想方案，能够显著提升Exchange-PAINT及相关方法的实验效率、重现性和试剂利用率，充分释放结构生物学研究的技术潜力。
为突破手动Exchange-PAINT成像工作流的固有局限，研究团队开发了一套专为多重SMLM成像定制的压缩空气驱动微流控平台。该系统采用模块化、可堆叠的创新架构设计，理论上可容纳无限数量的进样通道，从根本上解决了传统注射泵式方案的通道扩展性瓶颈。每个模块均配备独立可控的电磁阀，通过外部气压驱动运行，无需笨重的注射泵或复杂执行机构，大幅缩减了系统体积，可根据实验需求灵活扩展通道容量。
图1. 用于多路SMLM成像的微流控系统。(A) 微流控平台的示意图，展示了主要组件：手动或自动控制器、用于分配气压的电磁阀组、加压试剂管、带管路连接的样品室，以及溶液排入废液室的结构。(B) 组装完成的微流控装置实物图。其模块化且可堆叠的架构可灵活增加通道数量，温和且可重复的流体处理方式则确保了与多路超分辨率成像流程的兼容性。
系统运行时，压缩空气对试剂管施加压力，以低于1巴的可控压力将溶液输送至样品腔室，既兼容实验室集中供气管路，也可使用便携式压缩机。电子控制的电磁阀负责选择具体的溶液输送通道，响应时间极短。成像链溶液通常采用2毫升小体积试管存储，洗涤缓冲液则使用15毫升大容量试管供应。为最大限度减少死体积并防止重力回流，试管支架安装位置贴近样品并与腔室高度保持对齐。溶液通过生物相容性管路输送，废液可手动排出，针对敏感样品则采用蠕动泵实现温和、稳定的洗涤效果。
这套微流控系统实现了快速、可重复的缓冲液交换，同时试剂消耗量极低。针对常用培养皿规格，仅需1毫升溶液即可在30秒内完成完全交换。阀门启动到溶液抵达样品的响应时间稳定在1秒以内，溶液间携带污染可忽略不计。系统控制方式灵活多样，既支持简易手动开关盒操作，也可通过自动化控制器实现最多48通道的程序化控制，开放式设计还支持Python、MATLAB等编程环境接入，便于融入各类定制化实验室基础设施。自动化工作流可精确编程每次溶液交换的顺序、时机和持续时间，确保实验重现性，最大限度减少人为操作差异。
尤为重要的是，这套流体系统独立于光学路径运行，可广泛兼容商用和定制化显微镜平台。研究团队已验证其在宽场和共聚焦SMLM系统上的集成效果，其设计理念可无缝部署于各类成像平台，无需对显微镜主体或检测方案进行改造。
三、PDMS芯片制备与微流道加工工艺要点
在微流控芯片制造领域，聚二甲基硅氧烷（PDMS）凭借其优异的光学透明度、生物相容性和气体渗透性，成为生物医学研究中最常用的芯片材料。PDMS芯片制备工艺相对成熟，通常采用软光刻技术进行微流道加工。完整的PDMS芯片加工流程包括模具制备、材料浇筑、固化成型、打孔键合等关键步骤，配套的PDMS加工设备如PDMS等离子键合机、PDMS对准平台、PDMS热板、PDMS烘箱、PDMS浇筑器、PDMS打孔器等共同构成了完整的PDMS芯片加工平台。
PDMS模具是芯片制备的核心基础，常见类型包括SU8光刻胶模具、纯硅模具、树脂模具等。光刻胶模具通过光刻工艺在硅片上制备SU8胶结构，是最经典的微流控模具方案；硅模具则通过深硅刻蚀工艺制备，具有更高的精度和耐用性；树脂模具则适合快速原型验证。PDMS浇筑过程中，预聚物与固化剂按比例混合后脱泡浇筑于模具表面，经PDMS热板或PDMS烘箱加热固化后剥离，即可获得带有微纳结构的PDMS基片。
键合是PDMS芯片制备的关键工序，PDMS等离子键合机通过等离子体处理激活PDMS表面，实现与玻璃或其他PDMS基片的不可逆键合。PDMS键合对准平台则确保上下层芯片的精确对准，对于多层结构的复杂微流控芯片尤为重要。PDMS工作站集成了多种加工功能，为芯片制备提供一体化解决方案。对于器官芯片加工、3D细胞培养芯片加工等应用场景，专业化的器官芯片加工平台和3D细胞培养芯片加工设备能够提供更具针对性的工艺支持。
四、MEMS微纳加工技术在微流控芯片制造中的应用
微机电系统（MEMS）加工技术为微流控芯片制造提供了高精度的工艺基础。微纳加工平台整合了光刻、刻蚀、镀膜等多种工艺，能够实现微米乃至纳米级别的精细结构加工。MEMS微纳加工技术涵盖表面微加工和体微加工两大技术路线，MEMS工艺的不断进步推动着微流控芯片向更高集成度、更复杂结构方向发展。
光刻是MEMS加工的核心工艺之一，通过光掩膜版设计将图形转移至光刻胶层。传统紫外光刻可实现微米级分辨率，而电子束光刻技术则能够达到纳米级加工精度，电子束光刻机作为高端微纳加工设备，在研究型微纳加工实验室中应用广泛。电子束光刻胶对电子束敏感，能够记录纳米级图形，电子束光刻技术的工艺流程包括涂胶、曝光、显影等步骤，是制备高精度微纳结构的重要手段。
刻蚀工艺负责将光刻胶图形转移至基底材料，深硅刻蚀技术可实现高深宽比的硅微结构加工，硅的刻蚀工艺包括干法刻蚀和湿法刻蚀两大类。镀膜工艺则用于沉积各种功能薄膜，电沉积镀膜、物理气相沉积等技术可制备金属、氧化物等多种薄膜材料，薄膜表面微结构加工为芯片提供特定的表面形貌和功能特性。阳极键合技术则实现硅片与玻璃片的高强度键合，是微流控芯片封装的重要工艺。
MEMS代工服务为缺乏自有加工能力的研究团队提供了便捷的制造渠道。专业的MEMS加工公司和MEMS代工企业提供从MEMS定制设计到MEMS流片的全流程服务，MEMS代加工模式大幅降低了微流控芯片的研发门槛。MEMS微流控系统集成了微阀、微泵、微传感器等多种功能单元，代表着微流控技术的高级发展形态。光子微纳加工、激光纳米加工系统等新兴技术则进一步拓展了微纳制造的工艺边界。
微流控芯片的表面特性直接影响生物样品的吸附、结合和反应行为，芯片表面修饰技术因此成为生物芯片制备中不可或缺的关键环节。通过对载玻片或芯片通道内壁进行功能化处理，可以调控表面亲疏水性、引入特定化学官能团，从而优化生物分子固定效果、减少非特异性吸附。
醛基化修饰是常用的生物芯片表面处理方案，醛基玻片、醛基化修饰玻片能够通过席夫碱反应固定氨基修饰的生物分子，广泛应用于蛋白、核酸等生物分子的固定。羧基玻片则提供羧基官能团，通过碳二亚胺活化实现氨基分子的共价固定。环氧基修饰片表面带有环氧官能团，环氧官能化载玻片可直接与氨基、巯基等基团发生开环反应，具有反应条件温和的优势。
氨基修饰技术在芯片表面引入氨基基团，为后续偶联反应提供活性位点。PEG修饰（聚乙二醇修饰）则是减少非特异性吸附的经典方案，PEG修饰载玻片能够显著降低蛋白和细胞的非特异性结合，长效亲水处理和长效疏水处理可根据实验需求调控表面润湿特性。亲水修饰改善溶液在微通道中的流动特性，疏水修饰则用于构建液滴微流控等应用场景。
功能化载玻片的种类丰富多样，生物芯片醛基化载玻片、氨基修饰的磁珠等产品为不同生物检测应用提供了针对性的表面解决方案。生物芯片修饰工艺的持续优化，不断提升着微流控芯片在生物传感、细胞分析、分子诊断等领域的应用性能。
微流控技术与细胞生物学的深度融合催生了细胞培养芯片这一重要研究工具。微流控细胞培养芯片能够在微尺度空间内精确调控细胞微环境，为细胞提供更接近体内生理状态的培养条件。细胞培养微流控芯片支持三维细胞培养模式，3D细胞培养芯片相比传统二维培养能够更好地模拟体内组织微环境，3D类器官细胞培养技术已成为药物筛选、疾病建模的重要平台。
图2. 微流控增强的Exchange-PASET五靶点U2OS细胞成像。细胞骨架和黏着斑靶点的连续成像：(A) 微管(MT)、(B) 波形蛋白(Vim)、(C) 肌动蛋白(Act)、(D) 斑联蛋白(Zx)、(E) 桩蛋白(Pax)，以及(F) 所有通道的合成叠加图。比例尺5微米。(G) 采用皮尔逊相关系数的互相关分析以热图形式展示。(H, I) 图(F)中白色矩形框所示的放大区域，突出显示纳米级结构细节与共定位情况。比例尺2微米。
类器官芯片代表着器官芯片技术的前沿方向，微流控类器官芯片将类器官培养与微流控技术相结合，实现了类器官培养过程的动态调控和实时监测。微流控类器官培养芯片可为类器官提供持续的营养供给和废物排出，模拟体内的流体剪切力环境。类器官微流控芯片在肿瘤研究、神经科学、发育生物学等领域展现出广阔应用前景。
器官芯片（Organ-on-a-Chip）技术通过微工程手段在芯片上重构器官级别的生理功能。单器官芯片专注于模拟单一器官的生理特性，肝器官芯片、肺器官芯片、肾器官芯片、脑器官芯片、血管器官芯片等不同类型的器官芯片分别模拟对应器官的微环境和功能。多器官芯片则进一步实现多个器官单元的串联共培养，用于研究药物代谢、器官间相互作用等复杂生理过程。人体器官芯片为药物研发提供了更具预测性的体外模型，有望大幅降低新药研发成本和周期。
微流控生物芯片还涵盖细胞分选芯片、细胞迁移芯片、细胞因子芯片等多种功能类型，分别应用于不同的细胞生物学研究场景。细胞共培养芯片支持多种细胞类型的共培养，Transwell细胞共培养模式可研究细胞间的旁分泌相互作用。微流控芯片设计的不断创新，持续推动着生物微流控芯片在生命科学研究中的深度应用。
七、U2OS癌细胞五重靶标成像验证
为验证微流控平台的实际性能，研究团队在U2OS癌细胞中开展了五靶标Exchange-PAINT成像实验。实验选取了细胞骨架-黏着斑界面的一组蛋白质作为检测对象，包括微管、波形蛋白、肌动蛋白等代表性细胞骨架成分，以及斑联蛋白和桩蛋白等黏着斑蛋白。这套靶标组合兼具延伸状纤维网络和纳米级黏附支架结构，为系统性能提供了严格的检验标准。
实验采用速度优化的正交DNA对接/成像链组合以最小化通道串扰，并采用抗体-纳米抗体预混策略进行标记，随后用非功能化纳米抗体进行封闭。微流控辅助的低盐充分洗涤确保各轮成像间成像链的高效去除，引入下一轮成像链前通过确认定位信号近乎完全消失来验证洗涤效果。这些措施确保了不同靶标的荧光信号高度特异，序贯成像过程中串扰可忽略不计。
实验获得了各靶标的高质量超分辨图像，平均定位精度优于11纳米。微管和波形蛋白纤维结构清晰可辨，黏着斑蛋白斑联蛋白和桩蛋白呈现出与其已知亚细胞分布一致的独特纳米尺度分布模式。皮尔逊系数互相关分析进一步验证了这些结构关系，细胞骨架结构之间（如肌动蛋白与微管、波形蛋白）表现出强重叠。正如其空间组织所预期，细胞骨架与黏着斑蛋白之间的相关性较低。
金纳米颗粒基准标记用于实现精确的后处理漂移校正和序贯成像靶标的精准叠加对齐。系统稳定性经多轮成像和洗涤循环量化评估：25分钟成像轮次内的漂移通常为100-300纳米，洗涤步骤引入的额外漂移为200-500纳米。相比之下，手动缓冲液交换往往导致微米级位移。基于基准标记的漂移校正有效补偿了观测到的漂移，实现了五轮成像的精确配准，无可检测的错位。
每轮Exchange-PAINT成像包含25分钟数据采集，随后2-5分钟用于成像链平衡，约5分钟用于微流控辅助的前序成像链洗脱，完整五重靶标数据集总采集时间约为2小时40分钟。重要的是，这些溶液交换过程试剂消耗极少且几乎无需人工干预，将典型的多靶标成像方案从数小时的手动操作转变为高度自动化的流程，显著提升了实验通量和工作流重现性。
为探索流体平台在更高要求生物系统中的适用性，研究团队在分离的小鼠心室心肌细胞中开展了Exchange-PAINT成像。这是首次利用DNA-PAINT技术在原代心肌细胞中实现五靶标超分辨成像。心肌细胞多重成像面临独特的技术挑战：这类细胞体积大（约100×30微米）且极为脆弱，各轮成像间需要极其温和的洗涤以避免细胞从盖玻片上脱落。
图3. 微流控增强型Exchange-PAINT技术对分离的心室心肌细胞进行5靶标成像。成像的蛋白质靶标如下：(A) 小凹蛋白-3（CAV3）；(B) 雷诺丁受体2型（RyR2）；(C) 连接蛋白-2（JP2）；(D) 连接蛋白-43（CX43）；(E) 肌营养不良蛋白（DYSF）。(F) 所有蛋白质靶标的叠加图像。(G) 采用皮尔逊系数进行的互相关分析，以热图形式呈现。(H) 图(F)叠加图像的放大区域，由白色矩形标注。
微流控系统在这方面展现出独特优势，能够执行彻底而温和的洗涤，同时不干扰细胞黏附。这一特性使得在同一心肌细胞内进行多靶标序贯成像成为可能。多细胞成像实验证实了该工作流的可重复性。与U2OS细胞实验类似，每轮Exchange-PAINT成像需要25分钟采集时间。但由于为保护细胞黏附需降低流速，洗涤步骤延长至5-8分钟，完整五重靶标数据集总采集时间约为2小时50分钟。尽管约束条件增加，微流控辅助的溶液交换确保了稳定的洗脱效率和各周期间可靠的成像连续性。
成像平面通常位于细胞内部数微米深度，因此与U2OS细胞中的全内反射/高斜入射层状光片照明相比，信噪比有所降低，平均定位精度约下降一倍。漂移校正基于互相关分析，定制的Python算法实现了序贯采集图像的精确叠加。
研究成功揭示了心肌细胞特化纳米结构域中多种蛋白质的空间组织与相互关系，包括小窝蛋白-3（CAV3）、2型兰尼碱受体（RyR2）、亲联蛋白-2（JP2）、连接蛋白-43（CX43）和肌萎缩蛋白（DYSF）。通过分离心室肌细胞上的Exchange-PAINT成像，可以同时实现多项重要观测：定位侧表面肌膜上的小窝蛋白-3阳性膜结构域（即小窝）及其形成横-轴小管系统的规则膜内陷；研究肌质网RyR2钙释放通道簇的组织结构；探索二联体裂隙内及小窝附近的RyR2结合与膜拴系蛋白亲联蛋白-2的局部分布；分析介导电盘处心肌细胞间电耦合的连接蛋白-43间隙连接半通道斑块的定位。
耐人寻味的是，钙敏感的膜融合与修复蛋白肌萎缩蛋白的亚细胞表达可精确定位至所有这些心肌细胞膜纳米结构域，可能起到稳定局部膜完整性的作用，为心肌细胞膜可塑性提供了结构基础。肌萎缩蛋白敲除心肌细胞的对照实验验证了信号特异性，在相同标记和成像流程下未检测到肌萎缩蛋白信号，而其他蛋白靶标不受影响。
互相关分析（皮尔逊系数）证实了这些结构关系。小窝蛋白-3、肌萎缩蛋白和亲联蛋白-2表现出高度共定位，与其在膜纳米结构域的协同功能一致，而连接蛋白-43和兰尼碱受体与这些结构的重叠较少。在同一细胞内分辨这些膜蛋白的能力，为心肌细胞纳米结构域的组织和功能提供了前所未有的细节，为心脏生理和疾病的关键机制研究带来了新的视角。
多重超分辨显微成像日益成为结构细胞生物学的标准工具，然而手动Exchange-PAINT工作流仍然劳动强度大、易受机械样本漂移影响、且难以在不同操作者间标准化。微流控技术的集成提供了精确可重复的溶液处理、最小死体积的快速交换以及复杂工作流的全自动化。这些能力对于心肌细胞等脆弱样品尤为重要，温和的溶液交换防止细胞从表面脱落，同时彻底洗涤避免周期间串扰。多种技术因素的结合，首次实现了原代心室心肌细胞的五靶标Exchange-PAINT成像。
该系统的适配性进一步拓展了其在各类显微镜平台的应用范围。与共聚焦显微镜的兼容提供了基于荧光寿命的多重成像途径，与光谱分离或RESI等先进DNA-PAINT模式的集成则为稳健、高通量纳米尺度制图的混合策略开辟了道路。系统自动化与深度学习采集的结合将实现自适应工作流，减少用户依赖的变异性。
与商用同类产品相比，这套平台具有成本效益高、开源、易于适配多种配置的优势，包括宽场、共聚焦、STED和MINFLUX等多种显微系统。其模块化可堆叠设计确保了无理论通道限制的可扩展性。综合来看，微流控技术正成为多重超分辨成像领域的变革性技术选择，为基础研究和转化诊断领域的标准化高通量成像开辟了新路径。
随着PDMS芯片制备技术的持续成熟、MEMS微纳加工工艺的不断进步以及芯片表面修饰方案的日益丰富，微流控芯片的制造成本将持续降低，性能将不断提升。器官芯片、类器官芯片等细胞培养芯片技术的快速发展，也将为超分辨显微成像提供更多更具生理相关性的研究模型。微流控与超分辨成像的深度融合，有望在未来几年推动生命科学研究进入全新的纳米尺度可视化时代。
| 参考文献：https://doi.org/10.1021/acsnano.5c18697 |
ZH_CN 
EN