液滴微流控与拾取放置技术融合：新一代智能细胞分选系统详解

1.    引言：形态学筛选对高效细胞分选的迫切需求

在现代生物技术与药物研发领域，基于形态学的高内涵筛选已成为不可或缺的核心工具。这种技术通过显微成像与先进图像分析算法的结合，能够精准检测活细胞或细胞结构在形状、尺寸和结构特征上的细微差异，为药物发现、细胞系开发和植物生物技术研究提供关键数据支持。特别是在植物细胞培养中，形态学分化特征是识别成功转化或突变细胞的重要依据，而在类器官芯片和 3D 细胞培养芯片研究中，细胞形态变化更是评估组织发育和药物反应的核心指标。

然而，传统的细胞分选方法在处理基于形态学的筛选任务时面临着严峻挑战。无论是有限稀释法还是传统的拾取放置技术，都存在效率低下、资源浪费严重的问题，无法满足大规模筛选和稀有细胞分离的需求。为了突破这一瓶颈，德国伊尔梅瑙工业大学的研究团队开发了一种创新的微流控转移工具（MTT），将液滴微流控技术与传统的拾取放置技术完美结合，实现了多个目标细胞在单个循环中的高效转移，整体性能相比传统方法提升了约 20 倍。这一技术突破为微流控细胞分选领域带来了革命性的变化，也为定制微流控芯片在生物医学领域的应用开辟了新的方向。

图1 采用中间液滴存储的改进型基于形态学的目标物分选流程。该方案及配套图像展示了通过图像分选对目标物进行分类所需的后续操作步骤。a) 样品制备与成像优化：仔细调节激发条件，以确保目标物间距和成像质量达到最佳。b) 图像分析与阳性靶点识别：系统根据形态学标准自动识别阳性靶点及其位置，并据此规划拾取顺序。c) 顺序拾取与液滴存储：借助微流控转移工具（MTT），拾取所有已识别的阳性靶点并将其封装至独立液滴中进行中间存储。d) 顺序放置与阳性靶点分离：将存储液滴序列中每个携带封装目标物的独立液滴分配至单个孔板或指定表面位置。图像展示了放置在吸液纸表面的聚合物目标物。所有位置移动均由x、y、z轴机械臂完成（详细信息见正文及补充信息）。e) 所搭建激发装置的图像，展示了培养皿中目标物的激发过程。f) 待分选的直径40–60微米不同颜色聚合物颗粒的图像。g) 配备毛细管和流体连接器的3D打印微流控转移工具（MTT）。h) 经顺序转移后在吸液纸表面分离出的50微米微球图像。

2.    传统细胞分选技术的效率瓶颈与挑战

传统的基于形态学的细胞分选主要依赖两种方法：有限稀释法和单目标拾取放置技术。有限稀释法基于泊松分布原理，通过将细胞悬液高度稀释后分装到多个容器中，期望获得单细胞培养物。然而，这种方法存在固有的效率缺陷 —— 为了确保 99% 的概率获得至少一个细胞，需要制备大量的分装容器，其中绝大多数（约 86%）会是空的，只有少数（约 14%）含有单个细胞。这种方法不仅耗时耗力，还增加了丢失稀有目标细胞的风险，尤其不适合低命中率的筛选任务。

图2 微流控转移工具（MTT）的设计与图像。a) 该图像展示了3D打印的微流控转移工具，其内部嵌入了一根长度为20毫米的熔融石英毛细管，该毛细管外径为360微米、内径为100微米。b) 该示意图展示了微流控转移工具的工作原理，包含液滴形成节点，同时可将吸取的目标物体嵌入液滴序列中。毛细管尖端需浸入含有各类待分选浸没物体的培养基中。吸取流速（\(( Q_{takeup })\)）产生流体力，将非黏附的目标物体吸入毛细管内。为吸取一系列经光学筛选的目标物体，需依次操控尖端对准每个目标，同时避免误吸非目标物体。为实现高效的单物体选取，需考虑物体间距（\((d_{space })\)）与毛细管间距（\((d)\)），以最大化单取效率。物体被吸取后，将沿毛细管被引导，随后在共流节点处被包裹入液滴中。此时，吸取的水相介质（\(( Q_{takeup })\)）与氟化油（\(( Q_{in })\)）融合。该节点通过将毛细管上端置于聚四氟乙烯（PTFE）管内形成。此结构可在聚四氟乙烯管内直接稳定、可重复地生成液滴，液滴在被分配至目标位置前暂存于管内。c) 该图像展示了3D打印微流控转移工具的细节，可见通道结构内部的打印层。外表面已喷涂清漆以提升透明度。d) 该X射线图像展示了液滴形成节点，清晰呈现了毛细管末端及其适配聚四氟乙烯管的结构，浅色部分为流道。e) 熔融石英毛细管与微流控转移工具的连接界面图像，显示毛细管插入微流控转移工具的状态。f) 毛细管尖端图像，配有直径50微米物体的尺寸参照标识。

传统的拾取放置系统虽然能够实现精准的单细胞分离，但同样受到吞吐量的严重限制。一个典型的拾取放置过程包括光学识别、决策制定、位置调整、目标捕获、转移到目标位置和验证等多个步骤，其中源与目标之间的往返移动是最耗时的环节。商业系统通常需要约 30 秒才能完成一个目标的转移，这意味着处理 300 个目标需要长达 100 分钟的时间。这种低效率使得大规模筛选变得不切实际，严重制约了形态学筛选技术的应用范围。

液滴微流控芯片技术虽然能够实现高通量的细胞分选，每秒可处理数千个液滴，但它在形态学分析方面存在明显不足。在纳升级甚至皮升级的微小液滴中，对细胞进行详细的光学形态分析非常困难，而且传统的液滴分选系统通常基于荧光信号进行决策，无法满足基于复杂形态特征的筛选需求。因此，开发一种既能保持拾取放置技术的形态学分析优势，又能具备液滴微流控高通量特点的新型细胞分选系统，成为了生物医学工程领域的迫切需求。

3.    微流控转移工具（MTT）的创新设计与工作原理

研究团队开发的微流控转移工具（MTT）是这一新型细胞分选系统的核心组件。该工具采用高分辨率 ProJet MJP 2500 Plus 3D 打印机制造，使用生物相容性聚丙烯酸酯 VisiJet M2S-HT90 作为打印材料。这种 3D 打印微流控芯片的制造方式相比传统的硅或玻璃微纳加工工艺，具有设计灵活、迭代快速、成本低廉的优势，特别适合小批量定制微流控芯片的需求。同时，为了解决 3D 打印材料表面疏水性不足导致的液滴稳定性问题，设计中直接将 PTFE 存储管集成到液滴形成结处，确保液滴在含氟聚合物材料内部生成，这一巧妙设计避免了复杂的芯片表面修饰工艺，如长效疏水处理或氟基涂层，大幅提升了系统的可靠性。

图3 实验装置的激发与成像单元。该图展示了源培养皿装置的实物图与示意图，装置由载物台支撑，载物台配备照明框架：a) 截面示意图：(1) 集成落射照明LED的U盘式相机；(2) 用于调节环形照明激发间隙的可调黄铜环；(3) 装有浸没式物体的6厘米培养皿；(4) 环绕培养皿的环形激发LED；(5) 支撑培养皿水平调节的调平框架；(6) 用于透射照明的平面LED阵列；(7) 用于精确定位的机器人X、Y载物台。b) 完整装配系统的实物图：完整的机器人系统，突出显示了相机(1)、微流控转移工具(MTT)(9)、储液管与氟化油管(8)以及源培养皿(3)。c) 透射照明模式：利用平面LED阵列(6)进行透射照明以激发物体。d) 环形间隙激发模式：采用蓝色LED(4)的环形间隙激发模式激发物体。

MTT 的核心创新在于引入了液滴作为中间存储单元。其工作原理如下：首先，通过精密的 XYZ 机器人系统将 MTT 的毛细管尖端移动到目标细胞上方，利用负压将目标细胞及其周围的培养基吸入毛细管中；随后，吸入的细胞悬液在微流控通道内与氟化油相遇，被分割成一系列独立的纳升级液滴，每个液滴中包含一个目标细胞；这些含有细胞的液滴被临时存储在连接 MTT 和注射器泵的 PTFE tubing 中，形成一个有序的液滴序列；当所有目标细胞都被拾取并封装成液滴后，MTT 只需进行一次从源到目标的移动，然后将存储的液滴序列逐一释放到指定的目标位置，如微孔板的各个孔中或特定的培养表面上。

为了实现稳定且可重复的液滴生成，研究团队对 MTT 的流体动力学特性进行了深入研究。他们发现，当油相流量（Q_in）与水相出口流量（Q_out）的比值保持在 1/2 左右时，能够生成最规则、最均匀的液滴序列。在典型的操作条件下，Q_out 设置为 20 μL/min，Q_in 设置为 6-18 μL/min，相应的细胞吸取流量（Q_takeup）为 2-14 μL/min。这种流量设置不仅能够确保稳定的液滴生成，还能避免对细胞造成机械损伤，同时防止吸入周围的非目标细胞。

4.    实验验证与性能基准测试

为了验证 MTT 系统的性能，研究团队首先使用不同颜色和尺寸的荧光聚合物微球进行了基准测试。实验中使用了三种微球：直径 45-53 μm 的蓝色荧光微球、53-63 μm 的绿色荧光微球和 48 μm 的红色荧光微球。这些微球被分散在含有 0.12% SDS 表面活性剂的水溶液中，以模拟细胞培养基的特性并减少微球之间的粘附。

图4 利用小提琴图展示了液滴序列规律性的统计分析：a)和c)为不同\(Q_{in } / Q_{out }\)比例下的液滴间距；b)和d)为不同\(Q_{in } / Q_{out }\)比例下的液滴长度（~体积）。主动控制的\(Q_{out }\)与\(Q_{ir }\)流量之间的质量平衡，决定了收卷流量（\((Q_{out }-Q_{n}=Q_{takeup })\)）。实验数据通过两种代表性液体——水和20%甘油溶液收集，以模拟常用的粘性介质。高亮区域代表与最高液滴和序列规律性相关的工作条件。

实验结果表明，MTT 系统能够高效地从混合微球群体中选择性地拾取目标微球。在优化的条件下，约 60% 的存储液滴中含有单个微球，约 33% 的液滴为空，只有约 5% 的液滴中含有两个微球，含有两个以上微球的液滴不到 1%。这种分布主要受源板上微球空间分布的影响，如果能够进一步优化微球的分散性，使用结构化的源板来精确定位每个微球的位置，理论上可以实现 100% 的单微球封装率。

在转移效率方面，MTT 系统展现出了惊人的优势。研究团队成功地在约 5 分钟内将 300 个微球转移到了目标位置，而传统的单目标拾取放置技术完成同样的任务需要约 100 分钟。这意味着 MTT 系统将整体处理效率提升了约 20 倍。此外，系统还支持两种不同的放置模式：表面沉积模式和浸没式沉积模式。在表面沉积模式下，液滴被放置在琼脂、滤纸等亲水表面上；在浸没式沉积模式下，液滴被释放到预先填充了培养基的微孔板孔中。两种模式都实现了 100% 的液滴转移成功率，证明了系统的通用性和可靠性。

图5 挑选过程前后的图像对比。左侧图像（a、c、e）展示了粒子场，红色圆圈标记的经颜色筛选的粒子代表直径为200微米的粒子自由空间。黄色圆圈表示MTT毛细管孔的位置，经编程设定可在挑选完高亮目标物体后回到初始位置。右侧图像（b、d、f）为筛选后的同一视野，可见经颜色筛选的粒子已消失（参见补充信息视频S2至S5）。

图6 液滴包裹物体的存储管路显微镜图像。a）单物体拾取的优化条件（视频流中排列的图像）。b）在未优化条件下通过随机吸液得到的静态占据液滴（使用外部数字成像系统拍摄的图像，管路内径：500微米）。c）吸液后液滴内的目标物体获取频率（\((N=350)\)）d）重新放置在吸液纸表面后的目标物体获取频率（\((N=3 ×80=240)\)）。

5.    生物应用与拓展前景

为了验证 MTT 系统在生物样本处理中的适用性，研究团队使用向日葵（Helianthus annuus）花粉进行了实验。这些花粉粒直径约为 20 μm，具有复杂的表面结构和独特的光学特性，对成像和分选系统提出了更高的要求。研究人员根据花粉的面积（300-320 μm²，对应直径 19.5-20.2 μm）和圆形度（0.9-1.0）设置了筛选标准，成功地从混合花粉群体中分离出了符合要求的单个花粉粒。

图7 定位操作的目标图像。a）使用的吸液纸阵列，带有已放置颗粒的放大斑点。圆形标记和标识符由激光打印机打印。A13/E1 对应位置的图像显示了沉积的物体。b）放置有液滴的96孔微量滴定板盖（红色培养基）。

图8 水合状态下向日葵花粉的示例性分选。a) 培养皿中分散的直径约20微米的花粉源群体。采用了基于图像的组合筛选标准，选取目标区域为\(300-320 \mu m^{2}\)（直径19.5–20.2微米）、目标圆形度为0.9至1.0的花粉。插图I同时满足这两个标准，II为尺寸过大的花粉，III为畸形花粉。b) 拾取后嵌入中间存储管内的示例性液滴包裹花粉。c) 存储有选定花粉的液滴存储序列的显微图像。d) 将存储的液滴滴至吸液纸上后放置的花粉图像，如图7所示。e) 纸面上花粉的放大图像。

实验结果显示，MTT 系统对 20 μm 花粉的分选效率与对 50 μm 微球的分选效率相当，证明了该系统能够处理小至 20 μm 的生物颗粒。这一结果为 MTT 系统在更广泛的生物医学领域的应用奠定了基础。未来，该技术可以应用于各种哺乳动物细胞和植物细胞的分选，特别是那些需要基于复杂形态特征进行筛选的应用场景，如干细胞培养、单克隆抗体开发和植物育种等。

此外，MTT 系统还可以与类器官芯片和器官芯片技术深度融合。在类器官培养过程中，精准的单细胞接种是确保类器官均匀生长和发育的关键。MTT 系统能够将单个干细胞精确地接种到 3D 细胞培养芯片的特定位置，为标准化的类器官培养提供了有力工具。同时，该技术还可以用于从复杂的细胞群体中分离出具有特定形态或功能的稀有细胞，如循环肿瘤细胞（CTCs），为液体活检和癌症早期诊断提供新的技术手段。

6.    结论与展望

德国伊尔梅瑙工业大学开发的微流控转移工具（MTT）成功地将液滴微流控技术与传统的拾取放置技术结合起来，解决了传统形态学筛选效率低下的瓶颈问题。该系统通过将多个目标细胞依次封装成独立的液滴进行临时存储，只需一次源到目标的移动即可完成所有目标的转移，将整体处理效率提升了约 20 倍。同时，系统保留了拾取放置技术在形态学分析方面的优势，能够基于复杂的图像特征进行精准的细胞分选。

MTT 系统采用 3D 打印技术制造，具有设计灵活、成本低廉、易于定制的特点，非常适合学术研究和小批量应用。未来，通过进一步优化毛细管的尺寸和形状，该系统有望能够处理更小的细胞（小于 20 μm）。同时，结合人工智能和深度学习技术，可以进一步提升图像分析的速度和准确性，实现完全自动化的细胞分选流程。此外，将 MTT 系统与其他微流控功能模块（如微流控 PCR 芯片、免疫检测芯片）集成，可以构建从细胞分选、培养到分析的全流程单细胞分析平台，为生物医学研究和临床诊断提供更强大的工具支持。

随着微流控技术的不断发展和完善，这种融合了液滴微流控和拾取放置技术的智能细胞分选系统必将在药物发现、再生医学、植物生物技术等领域发挥越来越重要的作用，推动生命科学研究进入一个更加高效、精准的新时代。

参考文献：DOI: 10.1039/d5lc00550g