在细胞生物学与微纳制造交叉领域，线粒体杂合细胞（transmitochondrial cybrids）的制备技术正经历从传统方法到微流控芯片技术的革新。传统方案依赖无丙酮酸 / 尿苷（PU）培养基进行选择性培养，而基于微流控装置的新方法突破了这一限制，实现了 PU 补充条件下的高效制备。本文将系统解析这一技术的核心流程、关键设备与材料，及其在organ chip、细胞治疗等领域的应用前景。
在传统方法中，使用不含丙酮酸/尿苷（PU）的培养基进行选择性培养对于生成转线粒体胞质杂种至关重要。在此，我们介绍一种利用微流控装置生成转线粒体胞质杂种的方案，该方案即使在添加PU的条件下也能发挥作用。我们描述了微流控装置的制备、部分细胞融合（线粒体转移）以及转线粒体胞质杂种的收集步骤。随后，我们详细说明了通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析确认胞质杂种中线粒体DNA（mtDNA）重新聚集和进行mtDNA分型的流程。
1. 线粒体杂合细胞制备的技术突破：从传统方法到微流控革新
线粒体杂合细胞作为研究线粒体功能与疾病关联的重要模型，其传统制备需通过去核供体细胞与 mtDNA 缺陷受体细胞融合，依赖无 PU 培养基筛选 —— 因 mtDNA 缺陷细胞（ρ⁰细胞）无法自主合成丙酮酸和尿苷，仅融合细胞可存活。但该方法存在筛选周期长、细胞活性低等问题。
微流控技术的介入实现了三大突破：一是 PU 补充条件下的选择性培养，通过微通道精准控制细胞微环境，无需依赖营养缺陷筛选；二是单细部分融合，利用微流控芯片的细胞配对结构（CPS）与微隧道设计，实现线粒体定向转移而避免细胞核融合；三是高效筛选与鉴定，结合 PCR 与限制性片段长度多态性（RFLP）分析，快速确认 mtDNA 来源。
这一技术依赖PDMS 芯片加工的高精度微结构 —— 通过软光刻技术制备的微隧道（长度 4-10μm）与细胞口袋，为供体（含 mtDNA 的 Purᵣ细胞）与受体（ρ⁰细胞）提供可控接触空间，配合 HVJ-E 病毒介导的融合体系，实现高效线粒体转移。
2. 核心实验流程：从细胞准备到杂合细胞收获
1) 供体与受体细胞的精准制备
实验需两类细胞：一是稳定表达嘌呤霉素抗性基因（Purᵣ）的供体细胞（如 HeLa 细胞），二是 mtDNA 完全缺失的 ρ⁰受体细胞（如 143B 细胞）。ρ⁰细胞制备需经溴化乙锭（EtBr）处理 30-60 天，每日更换培养基以清除 mtDNA，后续在 PU 培养基中培养 1 个月以上，通过 PCR 确认无 mtDNA 残留。
关键操作包括：
- 供体细胞需转入荧光标记基因（如 H2B-EGFP），受体细胞转入 mCherry 标记，便于后续追踪；
- 确保供体为 TK⁺、受体为 TK⁻，通过 BrdU 筛选清除未融合的供体细胞。
2) 微流控芯片的制备工艺
芯片制备以PDMS 材料为核心，通过软光刻技术实现微结构复刻，具体流程包括：
主模具制造流程示意图
- 光刻胶模具制作：在硅片上涂覆 SU-8 光刻胶，经紫外曝光、显影形成微隧道（第一层，2μm 厚）与细胞配对结构（第二层，26-28μm 厚），需精确对准两层图案（误差 < 0.5μm）；
- PDMS 浇筑与固化：按 10:1 比例混合 PDMS 预聚体与交联剂，倒入模具真空脱泡后，65℃烘烤 1 小时固化，切割后打孔形成进出液口；
- 芯片组装：将 PDMS 芯片与玻璃载片可逆结合，避免等离子键合导致的细胞粘附干扰，确保微通道密封性。
光掩模设计总结
（A）细胞配对结构（CPS）的变化。微隧道长度由箭头所示的细胞凹穴之间的距离定义。比例尺：30微米。（B）硅片、第一层（微隧道）和第二层（CPS）之间的对准概述。透过对准标记窗口可以看到硅片上的对准标记。箭头图案有助于确定对准的Y轴位置。（C）CPS/微隧道设计的放大图。显示了带有短（4微米长）微隧道的CPS。关于光掩模设计的详细信息，请参见图1、图2、图3以及所提供的CAD数据（dwg文件：掩模#4、#20和#27）。比例尺：30微米。
微流控装置制备流程示意图
（A）空的主模具。（B-D）PDMS芯片制备步骤（步骤2-7）。（E）收集的PDMS芯片。（F-I）微流控装置制备步骤（步骤10-14）。
（A）切割固化的PDMS（步骤6）。（B）剥离PDMS（步骤7）。（C）清空母模。建议将母模空置存放，以避免PDMS粘在硅片上。（D）将PDMS芯片放置在干净的载玻片上（步骤8）。（E–G）修剪并打孔以制作出口和入口（步骤10）。（H）连接硅胶管以制作入口储液器（步骤11–13）。（I）将PDMS芯片放置在35毫米培养皿中（步骤14）。（J）由于无需连接任何外部设备，微流控装置可配备盖子。G-I中所示的PDMS芯片并不完全相同。
3) 部分细胞融合与杂合细胞筛选
融合过程通过微流控芯片的流体控制实现：
- 细胞悬液（0.5-1×10⁵ cells/100μL）注入芯片，440×g 离心 1 分钟使细胞进入 CPS，形成 1:1 配对；
- 注入含 HVJ-E 与 Y-27632（ROCK 抑制剂）的融合培养基，37℃培养 1 小时促进胞质桥形成，实现线粒体转移；
- 筛选分两步：先用 Pur 培养基清除未融合受体细胞，再用 PU/BrdU 培养基淘汰供体细胞，最终获得纯合杂合细胞克隆。
通过微隧道进行细胞融合的流程示意图 在该示意图中，线粒体未被显示。
3. 关键技术与设备：从微纳加工到检测系统
1) 微流控芯片加工设备
- 光刻系统：紫外光刻机（如 Union Optical PEM-800）用于 SU-8 图案曝光，需配合镀铬玻璃掩膜（精度达 μm 级）；
- 等离子刻蚀机：用于硅片表面处理与微结构修饰，通过 O₂与 CHF₃等离子体实现亲疏水调控；
- PDMS 加工设备：包括匀胶机（控制光刻胶厚度）、烘箱（65℃固化）、打孔器（2mm 直径 biopsy trepan）等。
2) 细胞操作与检测工具
部分细胞融合的实现及后续分离
在本实验中，使用了具有105个CPS且带有短（4μm长）微通道的微流控装置。（A）实验概述。在CPS中捕获表达H2B-EGFP的HeLa细胞（供体细胞）和表达mCherry的\(143B\)细胞（受体细胞）后，通入融合培养基1小时，然后通入Pur选择培养基1天。本示意图中省略了线粒体。（B）融合细胞对的荧光图像。在本实验中，线粒体DNA未被可视化。细胞质中的mCherry从\(\rho^{0} 143 B\)细胞转移到HeLa细胞，表明它们之间发生了部分细胞融合。H2B-EGFP信号和mCherry信号分别以绿色和红色显示。相差：相差显微镜图像。融合前：细胞捕获后立即拍摄。融合后：通入融合培养基1小时后立即拍摄。所有图像放大倍数相同。比例尺：25μm。（C）B中所示融合细胞对的延时观察结果。实线箭头和虚线箭头分别表示HeLa细胞和ρ0143B细胞。星号表示从CPS外部移入的细胞。在通入Pur选择培养基的过程中，融合细胞自发分离，恢复为单个细胞。所有图像放大倍数相同。比例尺：50μm。部分数据已在Wada等人的研究中发表，1 此处根据出版商的版权政策进行重现。本文已获得CC BY许可。
使用了具有105个CPS、带有短（4μm长）微隧道或无微隧道（无隧道）的装置。（受体）细胞。实验使用表达H2B-EGFP的HeLa细胞（供体）和表达H2B-mCherry的\(\rho^{0} 143 B\)细胞进行。（B）第19天用方法2筛选的典型结果（另见图7）。在这些实验中，微流控（A）第8天用方法1筛选的典型结果（另见图7）。本实验使用具有1260个CPS、带有长（10μm长）隧道的微流控装置。左图：细胞的相差显微镜图像。箭头指示出现的集落。此时，供体细胞仍然存活。随后通过传代筛选，供体细胞被完全清除（数据未显示）。比例尺：500μm。右图：集落的放大相差显微镜图像和荧光图像。图11. 选择性培养期间出现的集落图像以相同放大倍数显示。比例尺：500μm。左图：使用短隧道装置的实验中细胞的相差显微镜图像。右图：使用无隧道装置的实验中细胞的相差显微镜图像。短隧道装置中出现明显的集落，而无隧道装置中未出现。绿色：供体细胞的细胞核（H2B-EGFP），红色：受体细胞的细胞核（H2B-mCherry）。图像以相同放大倍数显示。比例尺：100μm。
通过荧光显微镜观察确认线粒体DNA的存在 表达H2B-EGFP的HeLa细胞（供体）、表达H2B-mCherry的\(p143B\)细胞（受体）及所得胞质杂种的荧光图像。所有细胞均用PicoGreen染色。本实验中，使用短（4μm长）通道装置通过方法2生成胞质杂种（另见图7）。胞质杂种中存在细胞质PicoGreen信号表明线粒体DNA重新聚集。PG：PicoGreen。图像以相同放大倍数显示。标尺：50μm。
- 荧光显微镜：如 Olympus IX81，用于观察 EGFP/mCherry 标记的细胞融合状态；
- PCR 与电泳系统：通过 KOD 酶扩增 mtDNA 片段，结合 SspI 酶切与琼脂糖凝胶电泳，区分 HeLa（1854bp）与 143B（1289bp）来源的 mtDNA；
- 细胞培养设备：CO₂培养箱需维持 5% CO₂与 37℃环境，配合 PU 培养基（含 1mM 丙酮酸、1μg/mL 尿苷）实现杂合细胞扩增。
4. 应用前景与技术扩展
- 1）. 疾病模型与药物研发
该技术可构建含特定 mtDNA 突变的杂合细胞，模拟线粒体疾病（如 Leber 遗传性视神经病），用于药物筛选。结合organoid chip，可进一步构建 “杂合细胞 – 类器官” 模型，研究线粒体功能对组织发育的影响。
- 2）. 微流控技术的横向扩展
- 器官芯片集成：将线粒体转移模块与多器官芯片结合，研究跨器官线粒体代谢协同；
- 自动化筛选：结合数字微流控芯片，实现细胞配对、融合、筛选的全流程自动化；
- 3D cell culture：在芯片中引入水凝胶支架，模拟体内微环境下的线粒体转移效率。
- 3）. 技术优化方向
当前挑战包括：非贴壁细胞难以适配（依赖微隧道穿透的胞质桥）、HVJ-E 试剂停产（需替代病毒载体）。未来可通过微流控芯片表面修饰（如 PEG 涂层）改善细胞兼容性，或采用电融合技术替代病毒介导的融合。
参考文献：https://doi.org/10.1016/j. xpro.2025.103953
Dxfluidics product ( standard PDMS chip)
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| Product Code | Outline （mm） | Height （um） | Width （um） | Thickness （mm） | Chip material | Price （CNY） |
| K0001 | 45*20 | 50 | 50&100 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0002 | 45*20 | 50 | 80&100 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0003 | 45*20 | 50 | 50&100 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0004 | 45*20 | 50 | 100&300 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0005 | 45*20 | 50 | 50&100&150 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0006 | 45*20 | 50 | 100 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0007 | 75*25 | 100 | 100&300 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0008 | 52*25 | 100 | 100&150&200 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
| K0009 | 35*24 | 100 | 100&200 | 3+1 | PDMS+Glass | 300 |
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