一、研究背景：循环肿瘤细胞为何要“挤”过毛细血管
癌症转移是导致患者死亡的首要原因，而循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）正是这一过程的核心载体。当肿瘤细胞从原发灶脱落进入血液循环后，必须经历一段充满力学挑战的旅程——在大血管中承受数秒量级的高剪切应力，进入微循环后则可能因物理尺寸不匹配而长时间滞留于毛细血管网中。
人体毛细血管的管径通常仅为3至12微米，而肿瘤细胞的典型直径在15至20微米之间。这种显著的尺寸差异意味着，CTCs穿越毛细血管时必然发生剧烈形变并承受血管壁施加的挤压应力。越来越多的研究表明，这种力学刺激并非被动的物理过程，而是通过机械转导（mechanotransduction）深刻影响着细胞的命运——重塑细胞骨架、改变核纤层蛋白表达、诱导细胞出泡，甚至触发上皮-间充质转化（EMT），最终增强肿瘤细胞的存活几率与侵袭转移潜能。
然而，以往的研究大多聚焦于剪切应力或单一维度的挤压效应，缺乏对挤压应力”强度”与”持续时间”两个关键参数的解耦分析。上海交通大学船舶海洋与建筑工程学院与南方科技大学海洋高等研究院的研究团队正是瞄准这一空白，采用微流控芯片技术搭建了体外力学刺激平台，系统探究了挤压应力的时空特性对细胞活性的独立调控作用。该研究成果发表于《实验流体力学》，为力学生物学与肿瘤转移机制研究提供了重要的实验依据。
二、实验平台：PDMS微流控芯片的设计与精密加工
要在体外精准模拟毛细血管环境，微流控芯片是目前最为理想的技术手段。研究团队首先对人乳腺癌MCF-7细胞系的直径进行了实验测量，确认其平均直径约为17微米，以此为依据设计了七种不同结构的微流控芯片。
图 1 MCF-7 细胞系直径分布
图 2 微流控芯片设计图（上：剪切组；下：挤压组）
芯片主要分为两类：一类是无收缩的直通道芯片（剪切组），通道宽高均大于细胞直径，用于模拟单纯的流动剪切应力；另一类是包含50条平行微通道的挤压组芯片，微通道高度统一为15微米，宽度设置为9微米、12微米和15微米三种梯度（对应不同的挤压应力强度），长度则设置为100微米与500微米两种（对应不同的挤压持续时间）。通过宽度与长度的正交组合，形成了六种应力加载条件，从而在体外复现了CTCs在微循环中所经历的力学微环境。
在芯片制备方面，研究团队采用了经典的软光刻工艺：首先使用Auto CAD完成微通道结构设计，随后利用SU8光刻胶在硅基板上制作光刻胶模具，再经过配胶、匀胶、脱气、浇筑、固化、剥离、打孔、清洗、干燥等标准微加工步骤，得到聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片。PDMS材料因其良好的光学透明性、生物相容性和弹性形变能力，成为细胞力学生物学研究中最常用的芯片基材。将PDMS芯片与洁净载玻片进行氧气等离子体处理后键合，并置于110℃热台上加热90分钟加固，最终获得密闭性良好的微流控芯片。
这一加工流程几乎涵盖了PDMS芯片制备的全链条关键环节——从SU8模具的光刻成型、PDMS浇筑脱模，到等离子体表面活化与键合，再到热板固化加固。对于缺乏超净间条件的研究团队而言，选择专业的PDMS芯片加工平台或微流控芯片代工服务，可以大幅缩短从设计到实验的周期。目前市面上成熟的PDMS芯片加工设备通常集成了PDMS等离子键合机、PDMS对准平台、PDMS热板、PDMS烘箱、PDMS浇筑器和PDMS打孔器等功能模块，能够实现从光刻胶模具到成品芯片的一站式制备。此外，对于需要更高精度或特殊材质的应用场景，MEMS加工工艺（如深硅刻蚀、阳极键合、电子束光刻）以及玻璃微流控芯片、COC芯片、PMMA芯片等替代材料也为微流控芯片定制提供了更丰富的选择。
三、实验方法：从细胞加载到高速显微观测
实验选用人乳腺癌MCF-7细胞系作为模型，使用RPMI-1640完全培养基在37℃、5% CO₂条件下培养。实验前将细胞消化、过滤制成单细胞悬液，重悬于添加1%泊洛沙姆188的基础培养基中，调整密度至3×10⁶个细胞/毫升。
图 3 实验装置示意图
挤压应力加载平台由可编程注射泵、玻璃进样器、PEEK管路、微流控芯片和离心管组成。注射泵以恒定流量推动细胞悬液通过芯片，使不同宽度微通道内的平均流速均维持在20毫米/秒。为避免细胞沉降，进样器内置钢珠并通过外部磁铁间歇性搅拌。每次实验收集150微升细胞悬液，整个操作控制在4小时内以保证细胞活性。
细胞穿越微通道的动态过程由配备高速摄像系统的倒置显微镜实时记录，拍摄帧率高达2000 fps，曝光时间0.5毫秒。研究人员将细胞通过时间定义为从前端进入通道到尾端完全离开的时间间隔，并人工排除通道堵塞、多细胞同时进入等异常数据。
在细胞活性检测方面，增殖能力采用Vybrant DyeCycle Green核染色剂标记，于接种后24小时和48小时通过荧光显微镜成像，再利用ImageJ软件进行自动细胞计数；粘附能力则在接种6小时后通过微分干涉对比（DIC）成像记录细胞铺展形态，结合Cellpose 3.0深度学习分割算法与MorphoLibJ插件定量分析单个细胞的铺展面积。这些方法的组合，本质上是在微流控细胞培养芯片的框架下，实现了对细胞”受力—响应”全过程的定量追踪。
四、核心发现一：挤压应力对细胞增殖的双相调控
实验结果揭示了一个耐人寻味的现象：挤压应力对细胞增殖的影响并非单调的，而是高度依赖于刺激的持续时间。
图 4 细胞通过微通道的过程
在100微米短通道中，细胞经受的挤压时间约为3毫秒。结果显示，随着通道宽度减小（即挤压应力强度增大），细胞的增殖能力呈现持续下降趋势。这意味着在极短时间的强挤压下，应力强度越大，对细胞增殖的抑制越明显。
而在500微米长通道中，挤压时间延长至约15毫秒，细胞增殖能力则随应力强度增大呈现”先增强后减弱”的双相趋势——中等程度的挤压（12微米通道）反而促进了增殖，只有最强的挤压（9微米通道）才显著抑制增殖。统计学检验表明，9-500组细胞在接种后24小时和48小时的数量均显著低于空白对照组（P<0.05）。
这一差异提示，长时间的挤压刺激可能激活了更为复杂的细胞信号转导通路。适度的力学刺激或许触发了细胞的适应性应激反应，促进了增殖相关通路的激活；而当应力强度超过某个阈值后，细胞损伤效应占据主导，增殖能力随之下降。这种”剂量-效应”的非线性关系，对于理解CTCs在微循环中不同滞留时长下的命运抉择具有重要意义。
图 5 细 胞 通 过 微 通 道 的 平 均 速 度 （ 箱 体 表 示 第 25–75 百 分 位 数（IQR），中线为中位数；须线延伸至不超过 1.5 × IQR 范围内的最远数据点）
图 6 接种后 24 小时细胞数量（数值为均值 ± 标准差,与 Control 比较，*P < 0.05
图 7 接种后 48 小时细胞数量（数值为均值 ± 标准差,与 Control 比较，*P < 0.05）
值得注意的是，细胞通过微通道的平均速度中位数在六种通道条件下并无显著性差异（P=0.65885），验证了通过改变通道长度来控制挤压时间的实验设计是有效的。但随着通道宽度减小，细胞通过速度的离散程度显著增大——小细胞可不变形快速通过，大细胞则需形变后缓慢穿行，其速度受自身直径、杨氏模量等力学特性影响更大。
五、核心发现二：挤压应力对细胞粘附的显著抑制
粘附能力是肿瘤细胞实现远处定植的关键环节。实验结果表明，与未受刺激的对照组相比，经历挤压应力的细胞在接种6小时后的铺展面积均出现下降，且长时间挤压的效应尤为显著。
在500微米长通道中，9-500组和12-500组的细胞铺展面积下降达到极显著水平（P<0.0001），15-500组也达到显著水平（P<0.05）。而100微米短通道组的下降幅度相对较小，仅15-100组达到边际显著。这清楚地表明，挤压应力能够显著抑制细胞粘附能力，且刺激时间越长，抑制效应越强。
图 8 接 种 后 6 小 时 细 胞 铺 展 面 积 （ 箱 体 表 示 第 25–75 百 分 位 数（IQR），中线为中位数；须线延伸至不超过 1.5 × IQR 范围内的最远数据点；与 Control 比较，*P < 0.05，****P < 0.000 1）
研究团队认为，这一现象的核心机制与挤压诱导的细胞骨架重组密切相关。根据已有研究，CTCs在毛细血管内受到的机械挤压会激活细胞内RhoA信号通路，进而触发F-肌动蛋白的密集组装，产生强烈的向心收缩力，使细胞由拉伸形态回缩为高皮层张力的球形状态。长时间的挤压使细胞维持在一种高张力的”收缩记忆”中，限制了其重新接种后与基质形成有效接触的能力，宏观上即表现为粘附与铺展能力的暂时性下降。
这一发现对于微流控芯片的表面修饰策略也具有启发意义。在细胞培养芯片或器官芯片的设计中，芯片表面修饰（如醛基化修饰、氨基化修饰、环氧基修饰、PEG修饰、亲水修饰或疏水修饰）直接影响细胞的粘附行为。如果实验对象本身已因挤压应力而处于”低粘附”状态，那么选择合适的功能化载玻片（如醛基玻片、羧基玻片、环氧官能载玻片）或进行长效亲水处理，就显得尤为重要。合理的表面修饰方案可以部分补偿挤压导致的粘附下降，确保后续细胞培养与分析的可靠性。
六、技术启示与行业展望
这项研究不仅在科学层面揭示了挤压应力强度与时间对细胞命运的差异化调控，也在技术层面展示了微流控芯片在力学生物学研究中的独特价值。
从芯片设计角度看，通过几何参数（宽度、长度）的正交组合实现力学参数解耦，是微流控芯片设计的经典思路。这种策略可以推广到更多场景——例如在类器官芯片中通过通道尺寸调控营养梯度，在细胞分选芯片中利用尺寸差异实现CTC富集，在细胞迁移芯片中构建梯度约束环境等。当前，微流控类器官芯片、微流控器官培养芯片和3D细胞培养芯片正成为药物筛选与疾病建模的热门工具，而对通道内力学环境的精确控制，正是这些平台能否真实模拟体内环境的关键。
从加工制造角度看，本研究所使用的PDMS软光刻工艺仍是学术研究的主流，但产业化应用对芯片的一致性、量产能力和成本提出了更高要求。玻璃微流控芯片凭借优异的化学稳定性和光学性能，在高分辨率检测场景中不可替代；COC微流控芯片和PMMA芯片则适合注塑量产；而MEMS微纳加工工艺（包括深硅刻蚀、薄膜沉积、阳极键合等）为硅基微流控器件和集成化微流控系统提供了技术基础。对于需要从原型走向产品的团队，选择具备微流控芯片定制加工能力、能够提供从设计、光刻、模具到键合封装全流程服务的微流控芯片公司，是加速研发的有效路径。
从未来研究方向看，作者也指出了三个值得深化的领域：一是进一步缩窄通道宽度以模拟更极端的毛细血管挤压，探究DNA损伤与EMT相关基因表达的变化；二是拓展研究对象，比较不同肿瘤细胞系乃至患者来源CTCs的力学响应差异，为精准医疗提供依据；三是从瞬时挤压转向周期性、长时间挤压刺激，更真实地模拟体内微循环的持续力学作用。这些方向的推进，无疑将对微流控芯片的通量设计、流体控制和检测集成提出更高要求，也为微流控技术与力学生物学的交叉融合开辟了更广阔的空间。
总体而言，这项研究以精巧的微流控芯片设计和严谨的定量分析，证明了挤压应力的强度与时间是调控细胞命运的两个独立且交互的变量。随着微流控芯片加工技术的不断进步和器官芯片、类器官芯片等平台的日益成熟，我们有理由相信，力学生物学的研究将从定性描述走向定量预测，为癌症转移机制的解析和抗肿瘤策略的开发提供更加强有力的工具支撑。
参考文献：doi:10.11729/syltlx20250121
ZH_CN 
EN