本研究引入由双乳化微流控技术制备、配备蜂毒肽生物孔的巨型单层囊泡（GUV），作为多功能微米级隔室用于单菌培养。相比传统方法，微流控制备的 GUV 具有快速、高重复性及尺寸和成分可控等优势，适合比较研究及高通量筛选。聚合物膜的稳定性与可调性支持多种实验需求，成孔处理使营养物质与抗生素可进入囊泡内，从而实现对细菌微环境的精确调控。
参考文献：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10953582/
1. 简介
抗生素耐药性严重威胁现代医疗，因此深入理解其机制对于开发新疗法至关重要。
群体异质性使细菌通过形成持久细胞对抗生素产生耐受性，研究这一现象需要单细胞或单菌落高通量筛选模型。
传统细菌培养方法存在通量低和分析手段有限的问题，而双重乳液和巨型单层囊泡（GUV）在单cell culture中展现出优势。
特别是由两亲嵌段共聚物如PDMS-b-PMOXA构建的聚合物GUV，具有良好的化学调控性和机械稳定性。
为实现营养和抗生素的通透，研究在GUV膜中插入蜂毒素形成的生物孔，并通过优化微流体双乳液技术制备用于封装细菌的GUV，实现细菌在封闭环境中的生长和响应分析。
结合共聚焦显微镜、流式细胞术及MALDI-ToF-MS，研究实现了对GUV中细菌活力、抗生素反应及生物膜形成的高通量分析，从而为研究细菌持久性和抗药性提供了新平台。
2. 研究内容
1) 双乳液模板化 GUV 的制备
研究中使用硅玻璃Chip中的六通接头，通过一步微流体液滴形成工艺制备了双乳液 GUV 模板，内水相 (IA) 与含 PDMS₍₂₅₎-b-PMOXA₍₁₀₎ 的聚合物有机相 (PO) 共流，外水相 (OA) 交叉流剪切形成单分散液滴，生成速率约为 0.3 kHz。
通过优化 IA 和 OA 的渗透压与粘度（如加入高分子量 PEG、使用 Pluronic F-68 和替代 PVA），在模拟细菌培养条件下获得了稳定的液滴模板，并能在 37 °C 下维持稳定超过七天。
挥发性有机溶剂（己烷:氯仿 3:2）蒸发后，双乳液转化为稳定的 GUV，但表面常残留聚合物袋。
使用 BODIPY 630/650 染色并结合共聚焦显微镜与圆霍夫变换算法分析，GUV 平均直径为 31.3±0.5 μm，具有高度均匀性，这对高通量筛选中评估细菌生长和生物膜形成动力学尤为关键。
2) GUVs 对细菌的封装
为实现高效、可重复地将活菌封装入大量 GUV，研究采用双乳液微流控技术，通过将指数生长期（OD₆₀₀ = 0.2–0.8）的 GFP 表达大肠杆菌直接加载于内水相（IA）中，实现快速处理并保持细胞活力。
生成的含菌双乳液经空气中挥发一小时转化为 GUV。
为评估包封效率与每个 GUV 的细菌数，使用共聚焦显微镜分析不同细菌浓度（OD₆₀₀ = 0.1–2.0）下的 GUV，结果表明低浓度下5–10% 为空 GUV，而 OD₆₀₀ ≥ 1.0 时几乎所有 GUV 均含菌。
每个 GUV 的平均载菌量在 OD₆₀₀ = 0.1–0.4 范围内为 2.4–5.7 个，且与理论值一致；但在 OD₆₀₀ > 0.4 时，菌数增加但变异性变大，可能由于细菌聚集干扰。
为优化封装均一性，建议上样浓度控制在 OD₆₀₀ = 0.2–0.8。
通过流式细胞术检测 GFP 荧光信号，发现 OD₆₀₀ = 0.4 可实现高信噪比且聚集最少，验证其为理想浓度，且两种方法（CLSM 与流式细胞术）得到一致结果。
3) 培养基对 GUV 限制细菌生长的影响
为评估 GUV 封装细菌在高通量筛选中的适用性，研究比较了三种常用culture medium（LB、TB 和 MSgg）对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌生长的影响。
结果表明，在营养丰富的 LB 和 TB 培养基中，大肠杆菌能在 GUV 内自由游动并在 37 °C 下于 36 小时内繁殖，生长倍增时间（DT）约为 10 小时，虽慢于常规培养但接近野生菌株水平；枯草芽孢杆菌在相同条件下也有类似生长趋势。
而在促生物膜形成的 MSgg 培养基中，两种细菌的生长都显著受限，显示出培养基选择对封装细菌的活力和增殖能力有重要影响。
4) 控制 GUV 的渗透性
为实现 GUV 在细菌培养与筛选中的应用，研究通过将成孔肽蜂毒素插入 PDMS‐b‐PMOXA 聚合物膜，实现其对营养物质和抗菌化合物的选择性通透性。
实验表明，将蜂毒素在双乳液生成过程中添加到外水相中，是在保持 GUV 稳定性的同时实现高效成孔的最佳策略。
利用封装 β-半乳糖苷酶和荧光底物 FDG 的酶促反应证实了分子通透性，并进一步通过 GFP 表达大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长、GFP 荧光及侧向散射信号的增强验证了通透性对细菌增殖的促进作用。
此外，使用 SYTO 9 染色结合流式细胞术分析表明，蜂毒素显著提高了原本细菌数量较少的 GUV 中的生长活性。
为评估抗生素作用，研究将含菌 GUV 暴露于高浓度卡那霉素中，发现蜂毒素通透处理使抗生素进入 GUV 并显著抑制细菌生长，荧光强度明显下降，且效应随蜂毒素浓度增强而增强。
5) 配备 Biopore 的 GUV 用于测试抗生素对抗生物膜的功效
为在 GUV 中重建生物膜并实现高通量筛选，研究评估了枯草芽孢杆菌在诱导生物膜形成的 MSgg 培养基中长时间生长的行为。
实验显示，细菌逐渐在聚合物膜界面沉积基质，并通过 SYPRO Ruby 染色和 CLSM 观察验证了生物膜形成过程，基质与细菌的比例随时间增加，且细菌与膜的共定位增强，表明其与膜相互作用加剧。
FRAP 结果和 POPC 实验表明，细菌分泌的胞外聚合物可增强膜流动性。
MALDI-ToF 质谱进一步确认了 GUV 内生物膜成分与天然生物膜的相似性。
在测试抗生素作用时，研究发现若在 GUV 成膜后即添加卡那霉素，会显著增加 PI 染色（死菌），而形成生物膜后再添加则抑菌效果减弱，表明生物膜增强了细菌耐药性。
此外，使用透化 GUV 封装 GFP-大肠杆菌，研究测试了不同浓度氨苄西林、卡那霉素和万古霉素的抑菌效果，结果显示 GFP 减弱、PI 增强，GUV 中细菌生长与死亡可通过流式细胞术定量。
使用 Gompertz 函数拟合得出的 MIC 值与常规测定一致，证明 GUV 平台可实现抗生素高通量筛选，具有广泛应用潜力。
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