dPCR技术原理及应用

PCR技术

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种体外扩增目标核酸的技术，已广泛应用于基因工程、医学分子诊断、环境检测等领域。

PCR技术是利用 DNA 聚合酶在适当的条件下，通过变性、退火及延伸等热循环过程，将初始目标核酸扩增数百万至数十亿倍。

根据定量性能，可简单地将它们分为定性 PCR、实时荧光定量 PCR（qPCR）及数字 PCR（dPCR）三类。

1.    dPCR技术原理和特点

dPCR技术主要由DNA扩增反应、荧光信号检测和数据分析三部分组成。

在DNA扩增反应之前，dPCR通过极限稀释模板，将其稀释至单个DNA分子水平，并将每个DNA分子分配到不同的反应单元进行PCR扩增。

扩增完成后，采集各反应单元的荧光信号。若反应单元有荧光信号，则记为1；无信号则为0。

含有荧光信号的反应单元至少包含一个靶DNA分子，但可能有多个分子。

因此，需要应用泊松分布计算，结合荧光信号阳性单元数、总反应单元数和模板稀释倍数，最终得到靶DNA分子的拷贝数。

dPCR的关键在于如何将每个靶DNA分子独立地分配到不同的反应单元。

根据实现方式的不同，dPCR可以分为微滴数字PCR（ddPCR）和微阵列芯片数字PCR（cdPCR）两种类型。

1)    微滴数字PCR

微滴数字PCR利用水与油互不相溶的原理，将油作为连续相，水作为分散相，通过特定方法生成微小液滴，这些液滴成为独立的反应单元。

通过微滴生成装置，能够产生数万个纳升或皮升级别的液滴，每个液滴中包裹有单个DNA分子和PCR试剂。

DNA扩增在每个液滴中独立进行，扩增结束后，检测并分析各液滴的荧光信号。

2)    微阵列芯片数字PCR

微阵列芯片式数字PCR通过设计芯片，将纳升级及以下的基因扩增体系独立分配到微量通道池中，再进行DNA扩增和荧光信号检测。

根据芯片的设计方式，微阵列PCR芯片可分为集成微泵阀芯片、阵列微池芯片和滑片式芯片三种类型： 

1. 集成微泵阀式芯片：通过多层软刻蚀技术在芯片上设计液体和气体通道，利用微泵阀控制液体的流动，将PCR扩增体系分配到独立的反应单元。 

2. 阵列微池芯片：芯片表面刻有多个微池，将模板和扩增试剂精确地分配到每个微池，形成大量独立的基因扩增反应单元。 

3. 滑片式芯片：在玻璃芯片上设计微流体通道和反应单元，通过滑动芯片将PCR体系从液体通道引入各个反应单元。

3)    dPCR技术特点

与第一代PCR和第二代qPCR技术相比，dPCR技术具有显著的优势，如高灵敏度、高特异性和高精确度等： 

1. 高灵敏度：dPCR可以检测到单个核酸分子，检测限低至0.001%。 

2. 高特异性、准确性和精密度：dPCR能有效区分浓度差异微小的样本，保证准确性。 

3. 广泛的检测范围：由于样本经过极限稀释，能够有效抵抗盐分和防腐剂等抑制物的干扰，适用于复杂样品的检测，如食品、动物血液和植物组织等。 

4. 绝对定量：dPCR无需内参基因或标准曲线，直接对靶DNA分子进行定量分析。 

5. 灵活的反应体积：反应体积可在几微升至几十微升之间调节，适用于不同样本的定量检测。

2.    dPCR技术在食品安全核酸检测中的应用

1)    食源性致病微生物检测

细菌检测：如大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、弯曲分枝杆菌等，dPCR可以通过靶向特定基因（如rRNA基因或毒力因子基因）进行定量分析，检测食品中的致病性细菌，即使其数量较低也能检测出来。对于食品中的病原微生物，dPCR能够提供更加精确的定量结果，帮助预警潜在的健康风险。

病毒检测：如诺如病毒、甲型肝炎病毒、胃肠炎病毒等，这些病毒常通过食物传播，尤其是海鲜和生食类食品。dPCR能够在食品样本中准确检测到病毒的遗传物质（RNA/DNA），并且具备高敏感度，能够识别极低拷贝数的病毒，保障食品中病毒的快速检测和控制。

2)    植物源性食品成分检测

转基因成分检测：随着转基因作物的广泛种植，食品中是否含有转基因成分成为食品安全的重要问题。dPCR可以通过靶向特定的转基因DNA片段（如GMO标志基因）来检测转基因成分的存在与含量。与传统PCR相比，dPCR无需依赖标准曲线，且能提供更高的定量精度，对于低含量的转基因成分尤其有效。

农药残留基因检测：dPCR可检测植物源性食品中残留的农药或其降解产物的基因标志物，避免了常规化学分析的繁琐与时间消耗。

食物成分标识：例如，检测食品是否标明有过敏原成分（如大豆、花生）等，确保消费者的健康与安全。

3)    动物源性食品成分检测

掺假与物种鉴定：dPCR可用于鉴定肉类的真实性，如鉴别牛肉、羊肉、猪肉等是否掺假，甚至检测肉制品中的特定物种成分。这对于市场上经常发生的肉类掺假现象具有重要意义。

动物源性病原检测：对于动物源性食品中的病原（如疯牛病、猪瘟等），dPCR能够快速、精确地定量病毒或细菌的含量。例如，检测猪肉中是否有猪瘟病毒或禽肉中是否含有禽流感病毒。

抗生素及药物残留：抗生素和激素类药物的残留是动物源性食品安全的一大隐患。dPCR通过检测特定基因的表达，能够间接或直接指示食品中的药物残留情况，为食品监管提供了更加可靠的依据。

4)    转基因食品成分检测

定量检测转基因成分：dPCR可用于检测转基因作物的DNA标志，精确量化转基因成分的比例。例如，可以用来检测玉米、大豆、棉花等转基因作物在食品中的含量，确保其不超过法规规定的安全限值。

低浓度转基因成分检测：传统PCR可能在低拷贝数情况下出现假阴性结果，而dPCR能够直接计算基因拷贝数，即使转基因成分在食品中的含量非常低（如0.1%以下），dPCR也能够准确检测到。

5)    食品病毒检测

病毒检测与定量：dPCR可用于检测食品中的病毒DNA或RNA，具有高灵敏度和高特异性，能够在病毒载量较低时就进行检测。对于食品中诺如病毒、甲型肝炎病毒等的监测，dPCR提供了高效且精确的方法。

安全性评估：通过定量分析食品中病毒的含量，dPCR可以帮助评估食品传播病毒的风险，尤其在流行病发生时，能够及时识别受污染的食品来源，减少食品病毒传播的风险。