单细胞RNA测序技术

参考文献：Advances in Microfluidic Single-Cell RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics – PMC

1.    单细胞RNA测序技术的进展

单细胞测序（SCS）方法主要包括microplate和微流控两类，其中以Smart-seq2为代表的微孔板方法可获取全长转录本，但通量受限；

而微流控方法通过将细胞分隔至纳升级反应腔中，显著降低交叉污染，并具备高通量、可定制性强等优势。

尤其在微流控装置与高密度微孔阵列的支持下，SCS不仅提升了数据一致性与处理效率，还为多样化生物样本提供了可扩展的分析平台。

1)    基于液滴的单细胞RNA测序方法

液滴微流控系统通过将细胞悬液分割成由油相包裹的水相液滴，实现单细胞的高通量封装与转录本捕获，目前的液滴式scRNA-seq流程主要包括细胞富集、液滴封装、逆转录及扩增、测序和数据分析五个步骤。

代表性方法Drop-seq和inDrop虽在条形码标记原理上相同，但在封装方式、逆转录环境及扩增策略上存在差异，前者使用刚性珠子统一RT反应并基于Smart-Seq的PCR扩增，灵敏度高但偏倚明显；

后者利用条码化水凝胶微球分别进行RT反应并采用CEL-Seq的线性IVT扩增，扩增偏差更低。

2)    基于微孔阵列的单细胞RNA测序方法

相比于液滴微流控技术，基于微孔阵列的scRNA-seq方法凭借其结构统一、操作简便和成本效益高等优势，可在整体水平上实现更无偏的单细胞测序。

此类方法通过纳升级或皮升级微孔作为独立反应器，利用重力装载单细胞，并在原位完成裂解、RNA捕获和逆转录。

代表性技术如Cytoseq、Microwell-seq和Seq-Well等，通过灵活的封闭策略（如机械密封、油封闭或半透膜）有效降低交叉污染，同时结合固相捕获、磁珠条码化和简化文库构建流程，推动了其在免疫学、神经科学等领域的应用。

3)    基于阀门的单细胞RNA测序方法

基于阀门的微流控芯片通过调节压力控制弹性PDMS膜阀门的开合，实现对单细胞的精准分离、捕获与处理，具备高灵敏度、高通量和低污染等优势。

代表性平台如Streets团队的自动化芯片、Hydro-Seq及Paired-seq等，通过优化阀门设计和通道结构，可有效排除杂细胞及游离RNA，适用于循环肿瘤细胞（CTCs）等珍贵样本的纯化与分析。

同时，商用平台Fluidigm C1支持多种文库构建协议，能够获取全长转录本，便于在临床样本中进行高质量表达谱分析。

4)    单细胞多组学分析

生物学中心法则揭示了DNA、RNA与蛋白质之间的相互关系，单一组学难以全面反映细胞功能与状态，因此单细胞多组学技术应运而生，以同时捕捉细胞在时间和空间维度上的动态变化。

微流控平台凭借其对单细胞精确操控的能力，成为整合转录组、蛋白质组、基因组乃至表观组学的理想工具。

如CITE-seq和REAP-seq可同时读取转录本与蛋白表达信息，适配体替代抗体进一步降低了成本；ASAP-seq与NEAT-seq则实现了对染色质可及性、转录本和蛋白的三重检测。

通过集成多层次数据，这些方法不仅能揭示细胞异质性、疾病进程及免疫调控机制，还为筛选潜在疾病标志物与关键调控因子提供了全新路径。

2.    空间转录组学的进展

尽管单细胞测序（SCS）能够揭示细胞间异质性，但无法解析细胞间及其与微环境的空间关系。

空间分辨转录组学（SRT）技术通过成像、激光显微切割（LCM）和测序三类方法，为研究组织发育、稳态与疾病机制提供了新的视角。

其中，测序类SRT因具备非偏倚、高通量和低错误率等优势而被广泛应用。

1)    基于阵列的空间转录组学（SRT）方法

基于阵列的空间转录组学技术通过表面或微珠捕获polyA RNA，在保留空间信息的同时实现转录组测序，广泛应用于组织异质性研究。

表面捕获方法如ST技术和其商业化平台Visium，通过在玻璃片上修饰捕获探针并赋予空间条形码，已实现从200微米至100微米的分辨率提升，后续如SM-Omics与SPOTS更整合蛋白分析以增强多组学能力。

微珠捕获方法如Slide-Seq和HDST则使用直径分别为10微米和2微米的磁性微珠构建高密度阵列，虽具备近单细胞级分辨率，但由于捕获效率不足及条形码映射到相邻切片而非当前组织，仍面临数据不足和定位偏差等挑战，特别在处理肿瘤等高度异质性样本时限制明显。

2)    基于微通道的空间转录组学（SRT）方法

基于微通道的空间转录组学（SRT）方法以其可调节的空间条形码分辨率和强大的多组学集成能力，为组织内生物调控网络的精细解析提供了新视角。

代表性技术DBiT-seq通过两块垂直交叉的PDMS微流控芯片在组织切片上构建空间像素网格，像素分辨率可达10微米，支持蛋白质组、转录组等多组学数据在同一组织上的高分辨率共解析，且兼容FF和FFPE组织切片。

该方法不仅适用于形态结构对齐的光学成像分析，还可通过修饰顺磁颗粒优化通道稳定性，提升组织适应性。

因此，以DBiT-seq为代表的微通道SRT策略具备良好的通用性和可扩展性，为多维空间生物信息的高精度捕获提供了强大支持。

3)    时空转录组

时空转录组技术通过结合空间位置信息与伪时间分析，能够动态捕捉细胞在发育、迁移及分化过程中的基因表达变化，为揭示细胞命运和生物调控机制提供了强有力的手段。

依托微流控平台在分辨率调节与高通量采集方面的优势，该技术可实现多时间点、多组织尺度的非偏倚分析，尤其适用于哺乳动物胚胎如小鼠和人类在器官发生过程中的研究。

诸如Slide-seqV2和Stereo-seq等先进平台已成功构建了小鼠大脑与眼部等器官的发育轨迹，甚至实现了人脑跨时间点的空间发育图谱描绘。

结合单细胞测序（SCS）与空间转录组（SRT），研究人员还揭示了肠道、四肢及造血干细胞（HSC）等关键系统的时空调控路径，并通过Visium等平台精确定义HSC的起源与调控因子。