微流控生物分子固定的作用

参考文献：Interfacial engineering for biomolecule immobilisation in microfluidic devices – ScienceDirect

1.    表面特性对生物分子固定化和细胞粘附的影响

当表面暴露于生物液体时，首先接触的是水分子，随后离子和生物分子（如蛋白质）附着在表面上，细胞最终接近并附着在已被生物分子层覆盖的表面。

生物分子的固定化是微流控设备开发中的关键步骤，其功能依赖于固定化生物分子的程度、方向和密度。

固定化过程复杂，受溶液特性和固定化表面性质的影响。

1)    蛋白质附着

蛋白质会吸附到所有非天然表面，表面湿润性是决定蛋白质附着及细胞反应的重要因素。

蛋白质吸附速率很快，且可能经历变性，吸附的蛋白质层往往是异质的，并且容易受到Vroman效应的影响，导致蛋白质交换、重排或脱附。

蛋白质在吸附过程中会假定特定的取向和构象，这一过程受表面化学、湿润性和电荷等因素影响。

蛋白质在疏水性表面上通过疏水相互作用吸附，而在亲水性表面上则通过氢键结合。

表面化学可以通过调节蛋白质的吸附取向和构象，进一步影响蛋白质的活性。

蛋白质附着动力学会因蛋白质类型和表面特性不同而有所变化，通常在中等电荷和低湿润性的表面上观察到最大蛋白质附着。

2)    细胞粘附

蛋白质首先接触表面，并充当细胞附着的锚或配体。

细胞通过与细胞外基质（ECM）蛋白质的相互作用附着并扩展，ECM提供机械支持并调节细胞功能。

细胞附着受表面湿润性、表面化学、电荷等因素的影响，适当的水接触角范围为40°-70°，例如，在接触角为55°的聚乙烯表面上，细胞附着最大。

表面功能团和细胞类型对附着的影响较小，预吸附的白蛋白也能促进细胞附着。

尽管表面化学影响细胞与表面的相互作用，但蛋白质构象如何决定细胞附着仍未明了，机械特性如刚度也对细胞附着和生长有影响。

2.    生物分子固定的机制类型

1)    物理吸附

物理吸附是通过分子间作用力（如静电力、疏水作用、范德华力、氢键等）将蛋白质吸附到表面的一种简单方法，通常不需要复杂的化学反应或试剂。

这种附着过程是异质的，蛋白质随机定向，以最小化自由能，但吸附较弱，容易受到Vroman效应的影响。

表面疏水性可能导致蛋白质展开，使用中介分子（如硅烷）可以防止这种情况。

物理吸附通常与共价或生物亲和力连接同时发生，且反应速度快，但可能导致生物分子形成多层。

2)    共价附着

共价固定通过生物分子的功能基团与适当修饰的表面形成不可逆的结合，提供高稳定性的表面覆盖。

常见方法包括使用双功能间隔分子，一端与表面共价连接，另一端与蛋白质结合。

该过程可以实现定向固定，但可能因构象变化或不良定向导致活性降低。

共价固定通常需要较长的孵育时间，是微流控分析前的预处理步骤，有助于避免非特定氨基酸基团的反应和变性。

3)    生物亲和力固定

生物亲和力固定比物理吸附提供更温和、定向且强大的蛋白质固定，具有高度特异性，减少了生物分子脱附的可能性，并提供更好的结合伙伴可接近性。

这种固定方法可通过化学、热处理或pH变化逆转，通常与共价或物理吸附结合使用。

DNA杂交、适体、抗原-抗体反应及亲和素-生物素相互作用在微流控设备中广泛应用。

3.    微流控生物分子固定的作用

1)    器官芯片

与传统二维细胞培养方法相比，微流控系统能更好地模拟人类器官的生理环境和细胞微环境，提供更接近体内的三维生理状态。

二维培养受限于平面表面，无法模拟体内环境中的细胞相互作用和化学梯度，而微流控系统通过引入液体流动和控制物理力（如剪切应力和血压），能够精确调控细胞生长的环境。

这些系统还可微图案化生物分子，促进细胞与细胞或细胞与基质的相互作用，优化细胞极性，增强其生理功能。

2)    POC传感与诊断

基于微流控技术的POC设备因其低成本、易用性和自我监测能力，正在革新诊断和治疗方法。

这些设备能够提供更高的自动化、少量试剂和更快的反应时间，且不依赖昂贵的实验室设备。

通过血液、汗液和尿液测试，可以在较少侵入的情况下检测体内的生物分子，如血糖、病原体和孕妇试纸等。

这些生物传感器通常使用酶、DNA和抗体作为识别分子，以高选择性和结合能力检测特定的抗原或核酸。

酶类因能在微流控设备表面高浓度固定化，通常能提供更高的检测灵敏度。

3)    单细胞与单颗粒检测与分析

单细胞检测主要聚焦于循环肿瘤细胞（CTCs），这些稀有的癌细胞从原发肿瘤脱落并进入循环血液，能够为肿瘤的进展、诊断和预后提供重要信息。

近年来，检测范围已扩展到通过细胞外囊泡（EVs）进行单颗粒分析，尤其是癌细胞分泌的外泌体作为癌症特异性标志物帮助早期诊断。

CTC分离面临挑战，因为它们在血液中极为稀少，且缺乏独特生物标志物。

微流控技术已被应用于CTC和EV的捕获、保存和分析，尤其是基于免疫亲和力的高通量平台提供了更高的灵敏度，能够揭示细胞的异质性并深化对疾病的理解。

此外，这些技术还可通过改进的微流控表面设计，如纳米柱、纳米纤维等，显著提高CTC捕获效率。

4)    基于实验室的生化分析

在实验室生化分析中，微流控设备提供了一种快速且廉价的方法，将ELISA、PCR和西方印迹等不同的蛋白质或核酸分析技术整合在一起。

这些技术需要将生物分子如DNA、蛋白质等固定在固体表面进行定性和定量分析，广泛应用于肿瘤学、神经学、炎症和传染病等领域。

与POC测试强调快速和简便不同，实验室测试通常需要多个步骤和复杂的试剂，由专业人员操作。

微流控技术提高了分析速度、灵敏度并降低了试剂消耗，同时能够自动化多个步骤。